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淀粉中-淀粉酶活性的测定 i-淀粉酶（i-1，4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶，ec3.2.1）是一种内切酶，可以从淀粉分子中随机切割-1和4。由于解离产物在还原性末端（c1）中的第一个碳原子性质为，因此被称为-淀粉酶。其已在淀粉加工、酒精制造、啤酒酿造、味精、酱油等生产,造纸和石油开采工业中得到了广泛的应用。由于温度决定了酶的催化效能和淀粉凝胶化的质量,所以温度对α-淀粉酶的活性和热稳定性的影响已成为广大消费者关注的焦点。 α-淀粉酶是一种钙依耐性蛋白酶,目前已有钙能提高α-淀粉酶活性和热稳定性的报道,但温度与热稳定性的关系,合适钙用量对α-淀粉酶的热稳定性影响缺乏深度报道。本实验借助DNS试剂并利用分光光度法建立了一种测定淀粉中α-淀粉酶活性方法。并讨论了淀粉浓度对α-淀粉酶活性和热稳定性的影响,探讨了钙的用量与α-淀粉酶活性及热稳定性关系,对酶的加入方式也进行了初步探索。旨在为α-淀粉酶的合理使用提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 电气池、电热池、dlp pHS-3C数字酸度计,7200分光光度计,HH-2数显恒温水浴锅,DHG-9060A型电热恒温鼓风干燥箱,全自动电光天平,直流稳压电源,真空干燥器,秒表等。 1.1.2 试剂及试剂 α-淀粉酶(武汉华润啤酒股份有限公司提供),按文献测定其酶蛋白浓度为1.94mg/mL;可溶性淀粉(AR):洛阳市化学试剂厂;玉米淀粉、一级淀粉:武汉太阳行食品有限责任公司;3,5-二硝基水杨酸(CP):浙江湖州食品化工联合公司菱湖望菱试剂厂。 DNS试剂的配制:称取3,5-二硝基水杨酸6.3g,苯酚5g,无水亚硫酸钠5g,固体氢氧化钠10.48g,酒石酸钾钠71.62g,用蒸馏水溶解后,定容至1000mL,于棕色瓶保存,放置2周后使用。 1.2 方法 1.2.1 活性糖凝剂工作曲线测定od 按DNS法,将酶液与可溶性淀粉溶液(pH 5.0,0.02mol/L柠檬酸溶于0.04mol/L Na2HPO4溶液中,用HCl和NaOH调pH值为5.0,buffer 1)于60℃水浴中预热3min～5min后,取0.2mL酶液(空白为0.2mL buffer 1)加到9.8mL 2%(w/w)的可溶性淀粉溶液中反应15min。取上述反应液0.5mL到1.5mL DNS试剂中,摇匀,沸水浴15min后,取出,迅速冷至室温。加入10.5mL蒸馏水,摇匀,于波长550nm处测OD值。标准麦芽糖工作曲线为y=0.7175x-0.0889,该曲线将用于计算酶反应过程中还原糖生成量。 α-淀粉酶活力的定义:在60℃和pH 5.0的条件下,每分钟水解可溶性淀粉产生1mg麦芽糖所需酶量为一个酶活力单位。 1.2.2 fer1添加时间对fer1糖活性的影响 取α-淀粉酶液2.0mL(2.328μg蛋白质(protein))到48.0mL buffer 1中,于不同温度培养,每隔一段时间(20min、40min、60min、80min、100min、120min)从混合液中取1.0mL(0.04656μg protein)到9.0mL的2%的可溶性淀粉溶液中,反应15min后,测各时段的糖产量,再转化为酶活力。 1.2.3 麦芽糖添加量的测定 取α-淀粉酶液0.5mL(0.582μg protein)到49.5mL用buffer 1配制的不同浓度(0%、1%、2%、3.5%、5%)的可溶性淀粉溶液(buffer 1)中,于80℃培养。每隔一段时间同时取2份样品。对于其中1份样品,取0.5mL混合液(0.00582μg protein)/(0.5mL buffer 1为空白)到9.5mL 2%的可溶性淀粉溶液中,其后续操作按α-淀粉酶活力测定方法进行。假定测得的吸光度值为OD1,则10mL溶液(0.5mL混合液+9.5mL 2%(w/w)的可溶性淀粉溶液)中的麦芽糖量(m1)可由下式给出: m1=20×(OD1+0.0889)0.7175(1)m1=20×(ΟD1+0.0889)0.7175(1) 对于另一份样品,取0.05mL混合液(空白为0.05mL buffer 1)到预先吸有0.45mL的buffer 1和1.5mL的DNS中,沸水浴15min后取出,冷却至室温,再加入10.5mL蒸馏水,摇匀。假定测得的吸光度值为OD2,则0.5mL混合液中的糖产量(m2)可表示为: m2=10×(OD2+0.0889)0.7175(2)m2=10×(ΟD2+0.0889)0.7175(2) 据此,底物中α-淀粉酶活力(A)可由下式给出: A=(m1?m2)(0.00582×15)(U/μgprotein)(3)A=(m1-m2)(0.00582×15)(U/μgprotein)(3) 由(2)式可求出50