热应激对奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白mrna转录的影响.docxVIP

热应激对奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白mrna转录的影响 热态是指身体在环境温度下产生的非特异性反应。高温可以诱导奶牛产生应激,引起一系列复杂的生理生化反应。研究应激机制,探寻应激敏感指标及其调控过程,是减少奶牛热应激造成的损失的关键所在。近年来,对热应激的研究已经深入到细胞水平,对小鼠肝细胞、人血管内皮细胞、奶牛外周血淋巴细胞等细胞的热应激研究有了相关报道。热应激能降低细胞的活力,诱导细胞凋亡。同时,热休克蛋白(HSPs)作为细胞受到各种刺激时产生的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族,在高温处理条件下可被诱导表达,并使细胞产生热耐受性,从而最大限度地降低高温对细胞的损伤。并且研究还发现,细胞的热应激调控过程因细胞类型、温度、作用时间的不同而存在差异。杜鹃和郭亮等报道了单一和连续间断的高温处理对奶牛乳腺上皮细胞生长和凋亡的影响,研究发现高温可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖并诱导其凋亡。 本研究以在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,对细胞进行持续高温处理,采用台盼蓝染色、细胞流式、RT-qPCR等方法研究热应激对乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白mRNA转录的影响,从而发现奶牛乳腺热应激反应的生物学变化,为缓解奶牛热应激和提高奶牛的生产性能提供参考。 1 材料和方法 1.1 牛奶乳腺癌上皮细胞的-结构测定 参照王治国和Hu等的方法将分离纯化后的奶牛乳腺上皮细胞,通过检测细胞中角蛋白-18进行鉴定后,用RT-qPCR和Western blotting方法检测奶牛乳腺上皮细胞的β-酪蛋白分泌,并分析染色体数目,绘制细胞生长曲线,证明体外培养的奶牛乳腺上皮细胞处于正常的生理状态和分泌功能,在体外培养的过程中没有发生转化。奶牛乳腺上皮细胞使用培养基(DMEM/F12+10%FBS)悬浮,并以大于2×105个的数量移入培养皿(Corning,430165)中,置于38 ℃的5% CO2培养箱中培养至细胞贴壁达80%~90%时,用0.25% 胰酶-0.02% EDTA消化传代。 1.2 细胞计数和独立计数 将奶牛乳腺上皮细胞以约1×104个·孔-1的浓度接种于24孔板(Corning,3524)中,分别置于38和42 ℃进行培养,采用台盼蓝染色法每天进行1次细胞计数,每天设3个独立重复, 连续7 d。未计数组每2 d换液1次,绘制生长曲线。 1.3 细胞凋亡的检测 将奶牛乳腺上皮细胞以约1×105个·孔-1的浓度接种于12孔板(Corning,3513)中,培养大约48~72 h,观察每孔细胞贴壁80%~90%后,分别置于38和42 ℃培养1、3、5和8 h,采用Annexin V-FITC KIT (EPIGEN Lot:030920)检测细胞凋亡。其主要过程为:①用D-Hank′s液清洗细胞2次,每次1 mL;②用不含EDTA的胰酶消化收集,对细胞计数,每0.1 mL样含1×105~5×105细胞;③用400 μL Binding Buffer悬浮细胞;④分别加入5 μL Annexin V-FITC和Propidium Iodide,混匀;⑤室温避光反应10 min;⑥用流式细胞仪(EasyCyte mini, Guava)检测,Annexin V-FITC用绿色荧光FITC通道(FL1)检测, PI用红色荧光通道FL3检测。 1.4 细胞rna的提取 将奶牛乳腺上皮细胞以约1×105个·孔-1的浓度接种于12孔板中,培养48~72 h,观察每孔细胞贴壁80%~90%后,分别置于38和42 ℃培养12 h后提取细胞RNA,每个处理3个重复。 1.4.1 样品处理和离心采集 采用Rneasy Mini Kit(QIAGEN)提取细胞RNA,其主要过程为:①用D-Hank′s溶液清洗细胞;②在12孔板中每3个孔加入约350 μL Buffer RLT吹吸均匀,转移至1.5 mL离心管后静置;③加入等体积的70%乙醇吹吸均匀(不可离心);④将700 μL样品转移至核试剂柱中(放于2 mL收集管中)于10 000 r ·min-1离心15 s,丢弃流通物;⑤往柱上加700 μL Buffer RW1,同样的速度离心15 s,然后丢弃流通物;⑥往柱上加500 μL Buffer RPE(事先用4倍体积乙醇稀释),以同样速度离心15 s,丢弃流通物;⑦往柱上加500 μL Buffer RPE,以同样速度离心2 min;⑧换新2 mL收集管,全速离心1 min;⑨换新的1.5 mL收集管,往柱上加20 μL无Rnase水,以10 000 r·min-1离心1 min来洗脱RNA;⑩往柱上加20 μL无Rnase水,以10 000 r·min-1离心1 min,再次洗脱RNA。提取RNA以后用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测,并