星点设计优化前阳离子脂质体的制备工艺及其性质考察.docxVIP

星点设计优化前阳离子脂质体的制备工艺及其性质考察.docx

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
星点设计优化前阳离子脂质体的制备工艺及其性质考察 病毒载体和非病毒载体是基因治疗中常见的两种传输系统。非病毒载体中阳离子脂质体被研究得最为广泛。阳离子脂质体的体外转染效果好,但体内应用时易与血浆中的成分(如血浆蛋白)结合生成聚集体在肺部引起肺栓塞。近年来,带有二硫键的脂质体骨架材料在生理pH条件下,整体带负电荷或显中性。二硫键的还原酶硫氧蛋白还原酶在肿瘤细胞中的表达量是正常组织的10倍。鉴于此,利用带有二硫键的脂质体骨架材料[2-[[4-[(羧甲基)二硫]-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯(CHETA, C36H61N3O4S2),构建了前阳离子脂质体来包裹质粒DNA,用于转染肝癌细胞HepG2。当前阳离子脂质体到达细胞表面,在二硫键还原酶的作用下,前阳离子脂质体转变为阳离子脂质体,从而与表面带负电荷的细胞融合。 星点设计近年来应用较多,可用非线性数学模型进行拟合,有实验次数少、精度高、预测性好等优点。现应用星点设计优化薄膜分散膜挤压法制备前阳离子脂质体的工艺。 1 实验部分 1.1 试剂和研究方法 pORF LacZ质粒(美国Invivogen公司);DMEM培养基(美国Giboco公司);[2-[[4-[(羧甲基)二硫]-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯(CHETA,自制);胰蛋白酶(美国Bio Basic Unit 公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);胆固醇和豆磷脂(上海伯奥生物科技有限公司);β-半乳糖苷酶报告基因染色试剂盒、鱼精蛋白硫酸盐(美国Sigma公司)。Sizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta电位分析仪(英国Malvern公司);JEM-100SX型透射电子显微镜(日本电子公司);Model-550型酶联免疫检测仪(美国Biorad公司);JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝科仪研究所)。 1.2 方法 1.2.1 干燥h2005 称取适量CHETA、豆磷脂、胆固醇溶于适量氯仿,旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂并在瓶壁形成均匀的薄膜,置真空干燥器中干燥2 h。加适量PBS溶液水化并溶胀薄膜,于细胞破碎仪上进行探头超声(200 W,100 s)形成澄清溶液,依次过400、200 nm的聚碳酸脂膜得空白前阳离子脂质体。取一定量鱼精蛋白贮备液,轻微搅拌下逐滴加入等体积DNA贮备液中,室温孵育10 min,再加入适量的空白前阳离子脂质体,继续室温孵育40 min,即得载基因前阳离子脂质体。 1.2.2 磷武酸溶液负染法 将前阳离子脂质体以纯水适当稀释,吸附于覆有碳膜的铜网上,以1%磷钨酸溶液负染,用滤纸吸取过多染液,自然晾干后置电子显微镜下观察并照相。取前阳离子脂质体混悬液,以纯水为分散介质稀释至适宜浓度,利用激光粒度及Zeta电位分析仪测定脂质体的粒径和Zeta电位。 1.2.3 细胞培养和转染 取处于对数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用完全培养基配成单个细胞悬液。将2.5×105·ml-1浓度的细胞接种于6孔培养板中,每孔加入2 ml单细胞悬液,37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养约24 h,使细胞达50%~70%的融合度。转染前用PBS溶液冲洗细胞2次,每孔中加入设计量的载基因前阳离子脂质体,并加入1 ml无血清、无抗生素的培养基。将细胞继续培养5~6 h后终止转染,移去介质,用PBS冲洗细胞2次,加入2 ml含有10%胎牛血清的完全培养基培养48 h。β-半乳糖苷酶活性的测定按试剂盒操作说明进行,总蛋白的测定采用二喹啉甲酸(BCA)检测法。以测量值减去空白值得样品β-半乳糖苷酶和总蛋白含量,转染效率=β-半乳糖苷酶量/总蛋白量(mU·mg-1)。 1.2.4 质粒dna的重量比 在预实验基础上,选择对平均粒径、转染效率影响较为显著的3个因素作为考察对象,即鱼精蛋白(Protamine)与质粒DNA的重量比(Protamine/DNA,X1);CHETA摩尔百分比浓度(CHETA,X2)和CHETA与质粒DNA的比例(CHETA/DNA,X3)。根据单因素试验结果以及在最高或最低水平时制备前阳离子脂质体的可行性,综合选择各因素的水平(表1)。 1.2.5 回归模型的建立及显著性检测 以平均粒径、转染效率作为指标(因变量),分别对各因素(自变量)各水平进行多元线性回归和二项式拟合。多元线性回归方程为:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3;二项式拟合方程为:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X1X2+b5X2X3+b6X1X3+b7X12+b8X22+ b9X32。式中,Y为各指标的测定值,b0为截距,b1~b9为回归系数,X1、X2和X3为所研究因素。采用数据处理软件包Statistica (vision 5.0)拟合各指标与各因素间的关系,计算回

文档评论(0)

lczslgy + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档