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血根碱对体外培养的人类宫颈癌hela和siha细胞的影响 宫颈发病率在中国女性生殖器官肿瘤中最高。因此，选择抗宫颈药物具有重要的开发价值。在中药中筛选有效且毒副作用小的抗肿瘤药物已成为中草药研究领域的热点之一。血根碱(sanguinarine,SAN)的化学名称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,分子量为367.8,它来源于罂粟科植物博落回的果实。早期的研究发现,它具有抗炎、抗菌、抗氧化作用,并对中枢神经有麻醉作用。近年来的研究发现,它还具有非常好的抗肿瘤功效,目前国内还未见任何SAN抗肿瘤研究的报道,即使在国外也主要集中在体外抗乳腺癌、前列腺癌等少数几种肿瘤的研究。2002年Ding等曾研究过SAN对抗药性宫颈癌细胞的影响。我们利用两种不同的人类宫颈癌细胞株研究了血根碱的抗肿瘤生长和转移作用。现报道如下。 1 材料和方法 1.1 细胞、培养基和血清 本实验中我们选择了He La细胞作为宫颈腺癌的代表,Siha细胞作为宫颈鳞癌的代表。这两株细胞均购于美国ATCC公司。SAN(99.0%)、胰酶、活细胞代谢物还原剂噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DM-SO)购于美国Sigma公司,D-MEM培养基和血清购于Gibcol公司。SAN由DMSO溶解制备成2 mmol/L的储备液,-20℃下保存备用。 1.2 酶活剂即充填液 取对数生长期的He La细胞和Siha细胞接种并培养于37℃、含5%CO2饱和湿度条件下24 h。直接采用培养液稀释SAN到实验所需浓度。对照组则仅加DMSO,其浓度与最高SAN药物浓度组一致,但所有实验中DMSO含量均低于1/104。 1.3 mtt法确定了抗癫痫对细胞生长的影响 1.3.1 mtt法培养适合不同的细胞系统 影响用0.25%的胰酶消化对数生长期的细胞,制备单细胞悬液,将5×104个/ml的He La细胞和Siha细胞分别接种于96孔培养板,每孔接种200μl。在37℃、含5%CO2和饱和湿度条件下培养24 h后,加入浓度分别为0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5和5.0μmol/L的SAN,每一浓度设6个复孔。然后在细胞继续培养24 h后,加入20μl浓度为5 mg/ml的MTT,再培养4 h后轻轻吸掉培养基。加入100μl DMSO振荡溶解10 min。在酶标仪上选取570 nm主波长和630 nm参考波长测定吸光度值,对照组细胞存活率设为100%,其余各组细胞存活率=(各浓度组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。 1.3.2 细胞存活率测定 细胞同上法培养24 h后,加入1.5μmol/L的SAN后分别于12、24、36、48和60 h时测定细胞存活率。其他实验步骤同1.3.1中所述。 1.4 细胞毒性检测 对数生长期细胞制备单细胞悬液,调整细胞浓度至1×106个/ml,将He La细胞和Siha细胞分别接种于直径为60 mm的培养皿中,培养24 h后加入0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μmol/L的SAN,每一浓度设3个复孔。继续培养24 h后用胰酶消化制备单细胞悬液,以500个细胞/皿接种至60 mm的培养皿,每个计量点设3个平行样,培养14 d后经PBS漂洗、甲醇固定、Gimsa染色。在显微镜下计数,含50个细胞以上的细胞集落作为一个克隆计数。 1.5 细痕的制备和生长抑制率的测定 采用体外划痕方法测定细胞浸润能力。取对数生长期细胞,按1×106个/ml接种于6孔培养板培养至细胞完全饱和。用无菌的200μl的枪头垂直划出一无细胞的细痕,制作培养细胞伤口模型。接着用PBS小心清洗3次,去除漂浮细胞(此时作为划痕后零时),每孔加2 ml培养基和0.5μmol/L SAN(此浓度对He La细胞和Siha细胞的生长抑制作用均10%)。同时设阴性对照组,每组设3个平行样。对照组和0.5μmol/L剂量组分别培养24 h和48 h后显微镜下观察划痕宽度,数码照相机拍照,测量划痕宽度。 1.6 b指示系统s 所有实验均重复3次以上,结果均以x±s表示。采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用方差分析,P0.05表示有统计学意义。 2 结果 2.1 两组患者治疗前后hela细胞存活率的比较 MTT比色法显示He La细胞和Siha细胞经SAN处理24 h后,细胞生长出现明显抑制,并呈现剂量依赖性(图1)。例如,与未处理对照细胞相比(设为100%),0.5μmol/L SAN处理后,He La细胞的存活率为85.3%(P0.05,95%CI为77.9%~92.8%);当SAN浓度增加为1μmol/L时,He La细胞的存活率降低到57.5%(P0.01,95%CI