血管紧张素在废用性肌萎缩过程中对骨骼肌肌纤维类型转化的影响.docxVIP

血管紧张素在废用性肌萎缩过程中对骨骼肌肌纤维类型转化的影响 根据这项研究，骨肌肉纤维可以改变运动的适应性，以及不同代谢功能的要求，骨肌肉纤维的大小和类型可以产生相应的适应性改变。在运动员停训之后, 内分泌水平也随之改变, 血管紧张素Ⅱ分泌水平降低, 然而血管紧张素Ⅱ降低后会对机体造成什么影响还是未知数, 本实验的目的就是施加外源性血管紧张素Ⅱ, 通过肌纤维百分比的变化探讨血管紧张素Ⅱ对废用性肌萎缩大鼠骨骼肌纤维类型转化的影响, 为改善运动员停训、航空航天、某些代谢型疾病引起肌纤维类型的转化提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 悬吊+angta 选用健康雌性SD大鼠32只, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, SPF级, 体重200～220 g, 按随机配对原则随机分为4组 (n=8) :即假手术组 (C) 、AngⅡ组 (CA) 、悬吊组 (T) 和悬吊+AngⅡ (TA) 。动物实验经由北京实验动物福利伦理委员会北京体育大学分会批准。 1.2 血管紧张素15的假手术 采用陈杰改良式大鼠尾部悬吊法建立废用性肌肉萎缩模型。大鼠单笼饲养, 尾部悬吊, 前肢着地, 后肢悬空, 身体长轴与水平面呈30°角, 在笼内可自由活动, 进食饮水, 室温保持在20～25℃, 人工控制室内照明, 每昼夜均保持12 h光照和黑暗交替循环。 对CA组和TA组包埋血管紧张素Ⅱ缓释泵, C组和T组进行假手术。假手术组和手术组大鼠先称体重, 然后用2%戊巴比妥钠按照0.3 ml/100g体重的剂量麻醉。然后碘酒擦拭消毒, 提起颈后部肌肉, 于两肩胛骨之间纵向切开一小口, 左右止血钳张开小口, 背部置入缓释泵, 缓释速率为200 ng/ (kg·min) , 14 d剂量, 然后用手术针线缝合伤口。假手术组缓释泵内装入的是生理盐水, 手术组缓释泵内装入的是血管紧张素Ⅱ。悬吊持续14 d。 1.3 肌组织块的制备 戊巴比妥钠 (45 mg/kg) 腹腔注射麻醉动物, 迅速取出左、右侧比目鱼肌称重, 切除两端肌腱, 在肌腹中段处取2×2×6 (mm3) 的组织块, 在冰块上用OCT包埋组织块, 投入液氮预冷的异戊烷溶液中冷冻后放入液氮中, -80℃冰箱保存。 1.4 肌球蛋白atp酶组织化学染色 用8 μm厚连续横断冰冻切片 (-20℃) 。参照Ogilvie和Feeback (1990) 以及王月丽、周越 (2008)改良的“异染性染料-腺苷三磷酸酶法”鉴别肌纤维类型。用pH值为4.35的预孵液进行肌球蛋白ATP酶组织化学染色, 实验过程中所有缓冲液都经pH测试仪准确调定, 使pH值相差均小于±0.01。其结果为:I型肌纤维深蓝色, IIa型肌纤维为白色, IIb颜色为淡蓝色, 即介于I型和IIa型颜色之间。 1.5 肌纤维类型分型 骨骼肌类型切片为10×10倍进行拍照, 图像用Image J 1.42软件进行肌纤维类型分型计算;收集的数据结果用平均值±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示, 用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析 (ANOVA) 。 2 悬吊过程对比目鱼肌复杂性的影响 C组CA组从整体上看, 肌细胞饱满, 轮廓清晰, 而T组肌细胞明显萎缩变形, 间隙较大, TA组较T组相比肌细胞有所改善。四组比目鱼肌湿重体重比值的统计结果 (表1) 显示, 悬吊之后T与TA组比目鱼肌湿重体重分别与C、CA组相比有非常显著性差异 (P0.01) , 说明悬吊过程造成了比目鱼肌的肌萎缩, 血管紧张素Ⅱ在悬吊过程中没有表现出抑制比目鱼肌萎缩的作用。 从各组Ⅱ型肌纤维百分比的统计结果来看, T组与C组相比Ⅱ型肌纤维百分比显著升高 (P0.05) , 说明在肌萎缩过程中, 出现了肌纤维类型从Ⅰ型向Ⅱ型的转化, TA组与T组相比Ⅱ型肌纤维百分比则显著降低 (P0.05) , 说明在肌萎缩过程中, 血管紧张素Ⅱ可以抑制肌纤维类型的转化。虽然在正常情况下, 血管紧张素Ⅱ对Ⅱ型肌纤维百分比没有影响, 但是CA组部分大鼠出现了Ⅱb型肌纤维, 而悬吊后TA组部分大鼠也出现了Ⅱb型肌纤维, 推测血管紧张素Ⅱ具有使Ⅱa型肌纤维向Ⅱb型肌纤维转化的作用 (图1, 表2) 。 3 血管紧张素在肌细胞转化中的作用 本实验结果显示, 悬吊造成的肌萎缩使肌纤维类型出现了Ⅰ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维的转化, Ⅱ型肌纤维百分比由对照组的17.69%上升到21.63%, 悬吊组与对照组相比有显著差异。ATPase染色结果也很明显, T组Ⅱ型肌纤维数量明显增多, 肌纤维细胞间隙较大, 且在切片过程中比较容易出现碎片现象。 安静状态下施加血管紧张素Ⅱ对Ⅱ型肌纤维总百分比没有影响。但是从ATPase染色结果显示, 安静状态下施加血管紧张素Ⅱ后使部分大鼠比目鱼肌快肌出现了Ⅱa型向Ⅱb型的转化, 这