cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响.docxVIP

? ? cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响 ? ? 苏雯晓 ，邓益琴，臧树军 ，王 茜, ，林梓阳, ，冯 娟 1. 上海海洋大学/水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300 3. 天津农学院，天津 300392 4. 海南大学 海洋学院，海南 海口 570228 溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 是一种广泛分布于海洋的嗜盐革兰氏阴性菌[1]。近年来，溶藻弧菌已成为我国水产养殖中主要的致病菌[2]，其引起的弧菌病可导致养殖动物表皮出血、肾脏发白、内脏充血，特别是在夏季较高的温度下致病率会显著提高[3]，造成严重的经济损失。2016年9月，马来西亚杂交石斑鱼 (Epinephelus polyphekadion × E. fuscoguttatus) 幼鱼感染溶藻弧菌，疾病爆发致大量死亡，且分离出来的溶藻弧菌感染鲈鱼死亡率达100%[4]。2019年8月，中国山东某养殖场的太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) 感染了溶藻弧菌，死亡率超过60%[5]。2020年3月，埃及赫尔格达养殖的幼年海参 (Holothuria atra) 感染溶藻弧菌后，皮肤发生溃疡并于3 d内死亡[6]。另外，溶藻弧菌还可以引起人类败血症、食物中毒等疾病[3]。因此，溶藻弧菌不仅能导致大规模的养殖动物死亡，造成负面经济影响，也是潜在的人与水产动物共患病源，可能对人类健康构成风险。 目前，在溶藻弧菌中，已经发现许多与蛋白相关毒力因子，如分泌系统、蛋白酶、生物膜、溶血性等。效应蛋白Val1686可以引起鱼类细胞凋亡[7]；溶藻弧菌的ncRNAVvrr1和丙酮酸激酶Ⅰ基因pykF相互作用，分别过表达Vvrr1和敲除pykF基因可以显著降低溶藻弧菌的黏附能力、生物膜形成和毒力[3]；敲除Ⅲ型分泌系统T3SS的调控蛋白操纵子基因exsD可导致溶藻弧菌对斑马鱼 (Danio rerio) 的毒力显著上升[8]；外膜蛋白A基因ompA缺失后涌动性和生物膜形成出现缺陷，溶藻弧菌毒力降低[9]；辅助定植因子acfA通过调节相关基因的表达来负调控生物膜的形成，从而影响溶藻弧菌毒力[10]；rpoS可调节细菌黏附能力，是溶藻弧菌毒力的关键调节因子[11]。因此，溶藻弧菌可能通过相关毒力因子或者毒力调控因子影响细菌对宿主的侵袭、黏附、定植以及毒力释放等过程，从而影响细菌对宿主的毒力作用。 几丁质结合蛋白 (Chitin-binding protein D,CbpD) 被视为一种几丁质氧化毒力因子[12]，它能够结合在几丁质上。几丁质结合蛋白结合几丁质后，能改变几丁质的物理结构，利于几丁质酶对其进行后续水解[13]。在铜绿假单胞菌(Pseudomona aeruginosa) 中，cbpD缺失导致宿主体内细菌的清除率提高，细菌和宿主蛋白质大量重组，使铜绿假单胞菌无法建立致命的全身感染，致病性降低[14]。目前，关于溶藻弧菌cbpD的研究甚少，前期基因组测序鉴定得到溶藻弧菌毒株ZJ-T中cbpD基因，通过同源重组的方法构建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突变株，并通过比较其与溶藻弧菌野生株ZJ-T的生长情况、运动性、药物敏感性等生物学特性以及毒力的差异，为进一步了解cbpD在溶藻弧菌中的功能提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株及质粒 溶藻弧菌ZJ-T、自杀质粒pSW7848、自杀质粒中间宿主大肠杆菌 (Escherichia coli) Ⅱ3813及接合作用供体宿主E. coliGEB883保存于本实验室；本研究所用菌株及质粒见表1，所用引物见表2。 表1 本研究所用菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study 表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study 1.1.2 主要试剂 用于E. coliⅡ3813生长的2-脱氧胸苷 (2-Deoxythymidine, Thy) 购于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。用于营养缺陷型E. coliGEB883生长的2,6-二氨基庚二酸 (2,6-Diaminopimelic acid,DAP) 购自西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司。高保真酶PrimeSTAR? Max DNA polymerase、限制性内切酶DpnⅠ购自宝日医生物技术(北京)有限公司；等温组装试剂盒 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；胶回收试剂盒MagPure DNA Clean