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利用微生物法制备核糖核酸rna酵母 废弃的母猪约占啤酒行业副产品的2.5%，螺母中的钠含量占干物质的6%8%。钠在制药行业、食品行业和食品行业中得到广泛应用。它的利用将给企业带来良好的经济效益。 核酸存在于一切活细胞中,是和蛋白质相似的生物大分子。核酸不仅是分子生物学的中心研究问题,也是生物化学的一个重要分支。酵母核糖核酸存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有生命形式中,它在蛋白质生物合成中起重要作用。核糖核酸在工农业生产、医药卫生、科学研究及人们的日常生活中有着越来越广泛的重要的作用。 核酸研究的首要方法是分离和测定。核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的的降解和变性,要尽量保持其在生物体内的天然形态,要制备天然状态的的核酸,必须采用温和的条件,防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌,尤其重要的是要防止核酸酶的作用。天然核酸都有生物活性,这是检验其质量的重要指标。 本实验采用碱法和盐法 1 材料和方法 1.1 核糖核酸乙酯酸乙酯类 酵母:辽宁天湖啤酒厂取来的鲜酵母 试剂:氢氧化钠,盐酸,氯化钠,无水乙醇,核糖核酸,乙醚。 仪器设备:2XZ-1型旋片式真空泵、JB-3A型定时恒温磁力搅拌器、HH-6数显恒温水浴锅、DJM50L胶体磨、PHB-4型便携式pH计、F-1004分析天平、SPECORD200紫外分光光度计。 1.2 rna的提取 稀碱法: 将10 g鲜酵母和少许石英砂加到研钵中,再加入一定量0.04 mol·L-1的氢氧化钠溶液,在研钵中充分研磨(此步是实验能否成功的关键)至少15 min,然后将匀浆液转移到大试管中,再用一定量 0.04 mol·L-1的氢氧化钠溶液分两次洗涤研钵,洗涤液并入匀浆液中。在水浴中加热25 min,冷却后以3000 r·min-1离心15 min,将上清液小心倾入盛有酸性乙醇溶液(体积分数95%乙醇30 mL加0.3 mL浓盐酸混匀)的小烧杯中,一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后,3000 r·min-1离心3 min,弃去上清液,再用体积分数95%乙醇洗涤沉淀、离心(同上)两次即得RNA粗制品。再用乙醚洗两次通过布氏漏斗抽滤就可得到RNA粉末。 浓盐法: 取湿酵母10 g,加入一定量的NaCl和水,控制盐质量分数在10%左右,搅拌均匀,置于95℃水浴锅中搅拌2 h,然后将提取液立即用自来水冷却10 min,装入离心管以3500 r·min-1离心10 min,将所得上清液倾于烧杯中并置于放有冰块的烧杯中冷却,待冷却至10℃下用6 mol·L-1盐酸调pH至2.4,调好后于冰水中继续静止10 min,使沉淀充分,将所得上清液以3000 r·min-1离心10 min得核糖核酸沉淀,将沉淀放于小烧杯内,用体积分数95%乙醇充分搅拌洗涤,可以去除残余杂质及色素,再用乙醚洗两次通过布氏漏斗抽滤就可得到RNA粉末。 1.3 rna含量检测 采用紫外分光光度计进行紫外光谱分析。 RNA含量测定: 标准RNA母液:准确称取RNA50.0 mg,用少量0.05 mol·L-1NaOH溶液湿透,研磨至糊状的混浊液,加少量蒸馏水混匀,调pH=7.0,再用蒸馏水定容至50 mL,配得溶液RNA质量浓度为1 mg·L-1。 标准RNA溶液:准确移取5.00 mL标准RNA母液置于容量瓶中定容到50 mL,此溶液含RNA质量浓度为100 mg·L-1。 RNA样品待测液:控制RNA质量浓度在10～100 mg·L-1范围内,取干燥RNA制品10 mg,配制方法同标准RNA母液,定容至100 mL,此溶液含RNA粗制品质量浓度为100 mg·L-1。 取一定量的已配制的RNA样品待测液,稀释一倍,在10～100 mg·L-1范围内吸光度A与RNA质量浓度呈线性关系,于紫外分光光度计上测定260 nm光吸收值。 计算RNA质量浓度公式为: RNA质量浓度(mg·L-1)=A260/(0.024×L) A260为260nm处光吸收值,L为1cm比色皿 2 结果与讨论 2.1 浓盐法提取核糖核糖最佳条件的确定 从所查得的资料及所做实验结果得出稀碱法提取核糖核酸的主要影响因素为NaOH浓度、碱裂解煮沸时间、pH值,最佳实验条件为NaOH质量分数为0.2% ,碱裂解煮沸时间25 min, pH值为5.5,将在此条件下所做实验部分数据列表1及图1。经比较表中的实验3效果最好得率高。 从所查资料及所做实验得出浓盐法提取核糖核酸的主要影响因素为盐质量分数、溶液pH值、升温速率,最佳实验条件为盐质量分数9.0%～11.0%、溶液pH值6.0～7.0、加盐后溶液温度迅速升至95℃,尽可能缩短20～70℃之间的停留时间,减少磷酸二脂酶的降解率。将在此条件下所做实验部分数据列表2及图2。经比较表中的实验4效果最好得率高。 2.2