抗虫棉对aybc、ayck和常规棉所的抗药性研究.docxVIP

抗虫棉对aybc、ayck和常规棉所的抗药性研究 生物适应度是指在环境中生存并继承后代的相对能力，通常包括生活能力和繁殖力。有研究表明,与敏感种群相比,抗性种群的幼虫发育历期和成虫繁殖能力都有所下降,抗性个体这种适合度劣势被称作适合度代价(fitness cost)。目前,许多报道都证实了适合度代价与Bt抗性相关,主要表现在抗性个体的生长发育、繁殖能力等生物学特性受到了不利的影响。本研究在室内使用双价棉、单价棉和非转基因棉作为筛选材料对棉铃虫室内种群进行了连续筛选,研究了转基因抗虫棉对不同种群棉铃虫生长发育、繁殖等生物学特性的影响,比较分析了筛选种群间适合度参数间的差异,明确了3个棉铃虫种群经过连续26代的抗性筛选后适合度的变化趋势。同时,通过对双价筛选种群与单价筛选种群的比较,明确了外源基因Cp TI的导入对棉铃虫抗性发展和种群适合度的影响。本研究旨在明确转基因抗虫棉的抗性风险、抗性发展动态和抗性机理,为棉铃虫的抗性治理提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 选择抗性棉铃虫品种 AYBC种群为室内用转双价基因(Cry1Ac+Cp TI)棉种子粉进行连续抗性筛选16代的棉铃虫种群;AYBT种群为室内用转Bt基因(Cry1Ac)棉种子粉进行连续抗性筛选16代的棉铃虫种群;AYCK种群为室内用常规棉种子粉连续饲养16代的棉铃虫对照种群。 1.1.2 转创不同品种棉的棉、棉产品 转Cry1Ac+Cp TI棉品种为中棉所41,转Cry1Ac基因棉品种为中棉所44,常规棉品种为中棉所49,以上品种均由中棉所科贸公司提供。 1.1.3 bt蛛蛋白测定 Cry1Ac毒素为Cry1Ac型Bt ICP 20%的MVPⅡ水剂(Mycogen公司生产);种子中Bt杀虫蛋白测定试剂盒为Envirologix公司的QualiplateTMKit for Cry1Ab/Cry1Ac;其它试剂均为市售分析纯。 1.1.4 主要试验设备 酶标仪,美国Bio-Tek公司;恒温光照培养箱,南京恒裕;样品研磨机,德国Ika公司。 1.2 测试方法 1.2.1 确定适宜的种子粉用量 按表1所示的组分和用量制备正常人工饲料。在此基础上添加一定剂量的种子粉制备抗性种群的筛选饲料。经测定,中棉所41种子中Cry1Ac蛋白含量为1018±159ng·g-1,中棉所44种子中Bt毒蛋白含量为1203±190 ng·g-1,根据应加入Cry1Ac蛋白含量换算成相应种子粉的含量。各代种子粉的加入量(表2)根据筛选种群的死亡率进行适当调节,控制种群的死亡率50%左右。 每一代棉铃虫初孵幼虫分别作如下3个处理:处理一为抗性筛选。根据上一代毒力测定数据,采用杀死种群50%个体的处理剂量,换算成相应种子粉的质量加入到融化的人工饲料中(表1,表2),混合均匀,作为筛选抗性种群的饲料。每个种群接2龄初幼虫3000头。处理二为抗性测定。将每个筛选种群的初孵幼虫在正常饲料上饲养至2龄初,进行LC50毒力测定。处理三为适合度调查。每一代每个筛选种群选取100头2龄初幼虫,接入加有饲料的试管内,每管1头并逐一加以编号,饲养饲料与抗性筛选饲料相同。观察记录各筛选种群适合度变化情况。 棉铃虫饲养条件:幼虫在20 mm×100 mm试管中单头饲养,试管用棉塞塞紧;成虫在产卵笼中用10%的蜂蜜水补充营养。饲养环境温度控制在(27±1)℃,相对湿度控制在60%~85%之间,光周期14∶10(L∶D)。 1.2.2 种群与饲料的配制 将Cry1Ac毒素配置成500μg·m L-1的母液,用无菌水配制7个不同浓度梯度备用(表3)。为了更准确地拟合浓度-死亡率曲线,AYBT种群使用1#-5#浓度,AYBC种群使用2#-6#浓度,对照AYCK种群使用3#-7#浓度,以清水作为空白对照。 按表1所示的组分和用量配制人工饲料,将仍处于液体状态的饲料倒入24孔培养板小孔中,每孔倒入饲料量不超过小孔深度的2/3,饲料凝固后,清除孔壁粘结的饲料。然后在24孔培养板小孔中分别加入100μL Cry1Ac毒素溶液,每个浓度的Cry1Ac毒素溶液处理一个24孔板,重复3次。待毒素溶液被完全吸收后,放在4℃冰箱中保存备用。 在24孔培养板中每孔接入1头2龄初幼虫,然后置于恒温光照培养箱中26±1℃避光饲养,5 d后检查幼虫死亡率。 1.2.3 成虫释放后的生殖 每天观察记录3个棉铃虫种群幼虫的存活情况和生长发育进度,化蛹后第3天称量蛹重。成虫羽化后,每个棉铃虫种群选择5对成虫释放到交配笼中(直径14 cm、高15 cm)交配,用10%蜂蜜水饲养成虫,每个种群重复3次。每天更换产卵用纱布,记载产卵数量。每个种群挑取落卵量最高的纱布放置在直径为9cm的培养皿中,用封口膜密封置于培养箱中遮光孵化,统计可孵化卵的数量,