高效液相色谱法测定l02人胎肝细胞内氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽.docx

高效液相色谱法测定l02人胎肝细胞内氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽 氨基葡萄糖是一种由谷氨酸、半胱酸和甘氨酸合成的三醇衍生物。广泛存在于各类组织细胞内。动物体内的谷胱甘肽主要由肝细胞分泌, 大部分以还原型谷胱甘肽 (GSH) 的形式存在, 在氧化胁迫 (oxidative stress) 等特定条件下可被氧化成氧化型的谷胱甘肽 (GSSG) 。GSSG/GSH比值是反映机体氧化还原状态的重要指标, 多种病理损伤可致氧化胁迫, 造成该比值升高, 如神经退行性疾病, 心血管疾病, 癌症等。精确测定组织或细胞内GSSG和GSH水平, 以反映组织氧化胁迫状态十分必要。已有文献报道了采用高效液相色谱 (high performance liquid chromatography, HPLC) 法检测血浆或组织中GSH的方法, 但对于细胞内GSH与GSSG的含量精确测定未见相关报道。 本文利用HPLC定量测定正常及处于氧化胁迫状态下L02人胎肝细胞中GSH、GSSG含量, 并以GSSG/GSH比值作为细胞内氧化胁迫状态指标, 以期建立可靠、准确、专属性强的细胞内氧化还原状态指标及标准化测定方法。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 细胞植物 L02人胎肝细胞, 购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。 1.1.2 siga-aldrity公司的纺粘设备 还原型谷胱甘肽标准品 (Sigma-Aldrich公司, 纯度≥99.0%) ;5, 5’-二硫代双硝基苯甲酸 (DT-NB, Sigma-Aldrich公司, 纯度≥99.0%) ;二硫苏糖醇 (DTT, Sigma-Aldrich公司, 纯度≥99.0%) ;TritonX-100 (北京拜尔迪生物公司, 纯度99.0%) ;甲醇 (天津市科密欧化学试剂有限公司) 为色谱纯;优级胎牛血清 (FBS, 浙江天杭生物科技有限公司) ;RPMI1640培养基 (GIBCO公司) ;其余试剂均为国产分析纯。 1.1.3 仪器、设备和仪器 Agilent1100Series高效液相色谱仪及色谱工作站 (Agilent公司) , TGL-16G-A-高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂) , 普通显微镜 (济南强胜光电仪器有限公司) , AL104型分析天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司) , BCM-1000型生物净化工作台 (苏州净化设备有限公司) , MCO-15AC型CO2培养箱 (三洋电器有限公司) , IX71倒置相差显微镜 (日本OLYMPUS公司) 。 1.1.4 保护柱和检测波长 XB-C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm, Welch Materials, Inc) , 保护柱为C18柱 (4 mm×2mm, Phenomenex公司) , 流动相为0.05mol/L pH5.6醋酸钠缓冲液-甲醇 (93∶7, V∶V) , 流速为0.8mL/min, 检测波长为320nm, 柱温为40℃, 进样量为20μL。 1.1.5 溶液的制备 1.2 方法 1.2.1 细胞正常与损伤 将L02细胞按4×105/mL的密度接种到含15%胎牛血清FBS的RPMI1640培养液中, 细胞分为正常组, H2O2损伤组。培养12小时后, H2O2损伤组加入终浓度为100μmol/L H2O2, 共孵育1h后, 胰酶消化, 收集细胞, 4℃下1000g离心10min, 弃上清收集并处理细胞。 1.2.2 重组蛋白的制备 将细胞沉淀悬浮于100μL PBS中, 再加入40μL 0.3mmol/L的EDTA和100μL 2%TrironX-100, 涡旋混合1 min, 裂解细胞。细胞裂解液分两份, 一份以Lowry法测定蛋白含量;余下裂解液加入200μL 0.15g/mL的三氯乙酸沉淀蛋白, 4℃下10000g离心10min, 收集上清液。 1.2.3 测定固氮基因的测定 1.2.3. dtnb-h3po4溶液的制备 取130μL上清液, 加入0.5 mL 500μmol/L pH 8.9的Tris-HCl溶液, 混合均匀, 加入20μL纯水, 再加入350μL 10mmol/L的DTNB溶液, 振荡混匀, 室温反应5min, 再加入100μL 7.0mol/L的H3PO4溶液重新酸化。10000g离心10 min, 上清液过0.45μm的微孔滤膜后, 进行高效液相色谱分析。 1.2.3. 高效液相色谱分析 取130μL上清液, 加入0.5 mL 500μmol/L pH 8.9的Tris-HCl溶液, 混匀, 加入20μL 10mmol/L的DTT, 反应5min, 向体系中加入350μL10mmol/L的DTNB溶液, 作用5min, 再加入100μL 7.0 m