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酵母双杂交系统的功能和蛋白质组学研究进展 随着人类工作组计划的加快，人们对收到天地间书籍并不满意。解读天地间和解码生活是当务之急。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的需要,DNA芯片技术、蛋白质芯片技术、蛋白双向凝胶电泳、基因表达系列分析、肽质谱分析等新技术不断涌现,其中酵母双杂交系统的应用日益广泛。 1 酵母双杂交系统的应用价值 酵母双杂交系统自1989年建立以来,短短12年的时间,其应用十分广泛,成果也十分丰富,尤其在细胞信号转导研究中具有重要的应用价值。 在细胞的信号转导中,物质与物质的相互作用是一种主要的信号传递形式。专门研究物质间(蛋白与蛋白、蛋白与核酸、蛋白与小分子配体等)相互作用的酵母双杂交系统正好符合信号转导的研究需要,对细胞的信号转导研究起重要的促进作用。 但在实际应用过程中,传统的酵母双杂交系统有不少的局限性,人们根据不同的需要对传统的酵母双杂交系统进行了改造,发展了多种新的技术。 1.1 蛋白质与蛋白相互作用 蛋白质与蛋白质除了直接相互作用外,在许多细胞内的信号传递过程中往往需要另外的分子参与,包括联结蛋白、多肽、激酶、RNA和一些小分子有机配体。这第三个分子可通过稳定诱饵蛋白与靶蛋白的相互作用,或作为桥梁介导两者的相互作用,或修饰其一后,引起两者的相互作用。这第三个分子可称为adaptor,目前研究较多的是蛋白质adaptor,如Grb2、Raf等在信号传递过程中都起重要的联结作用。传统的双杂交系统研究蛋白与蛋白的相互作用,小分子配体三杂交系统(small ligand three-hybrid sytem)开辟对非蛋白质的小分子有机配体的研究。如免疫抑制剂FK506与地塞米松的有机合成杂交分子,作为诱饵蛋白(糖皮质激素受体与BD的融合蛋白)的配体,从与转录激活域融合在一起的靶蛋白cDNA文库中,成功地筛选出了FKBP12蛋白,表明这种方法能鉴定非蛋白或多肽的小分子物质与蛋白质大分子的相互作用。以RNA介导蛋白与蛋白相互作用的RNA三杂交系统(RNA three-hybrid system)能够鉴定蛋白质与RNA的相互作用。从而通过已知靶RN A系统鉴定新的RNA结合蛋白,或通过已知蛋白筛选与之特异结合的RNA。 1.2 单杂交系统研究 许多细胞信号最终要导入核内,引起相关基因的表达改变,这就需要研究蛋白与DNA的相互作用。在此,单杂交系统是一项有效的技术。它是将要研究的DNA序列置于报告基因的上游,以这段特异性的DNA序列作为诱饵,去筛选cDNA文库编码的靶蛋白。单杂交系统将在基因调控等功能研究中发挥积极的作用。 1.3 分离双杂交系系统 在确定了蛋白质之间的相互作用后,进一步研究其结构与功能的关系及其调节显得十分必要。这不仅有利于鉴定那些阻碍蛋白相互作用的突变结构或突变单位,对筛选特异性蛋白相互作用的阻断剂也是十分有效的,必将增加人们对细胞内信号转导过程的人为控制能力。 1996年,Vidal等建立了反向双杂交系统,按照反选择策略,一类方法是设计一种能直接或间接地导致细胞毒性或死亡的报告基因,正常的蛋白相互作用后引发细胞死亡,而蛋白与蛋白结合区的突变或其他外界因素若干预蛋白间的相互作用时,报告基因就不表达,细胞得以存活,按此类设计,Vidal等引入URA3基因作为报告基因,该基因编码的酶能将培养基中加入的5-氟乳清酸转变为5-氟脲苷,5-氟脲苷进一步变为5-氟脱氧脲苷,它竞争性地抑制胸苷的合成,从而阻碍DNA合成,引起细胞死亡。在含α-氨基乙酸盐的培养基中LYS2报告基因的表达以及Gallo酵母在含半乳糖的培养基中GAL1基因的表达,均能产生细胞毒性物杀死酵母细胞。另一类方法则是将营养性报告基因(如HIS3)置于tet操纵子之下,若有蛋白相互作用,就表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵子上后抑制报告基因的表达,在营养缺陷的选择性培养基上,细胞不能存活,只有蛋白的相互作用被阻断后,转化子才能生长。该系统又称分裂双杂交系统(split-two-hybrid system)。反向双杂交系统在研究蛋白质的结构与功能,生物学制剂的筛选中发挥着越来越重要的作用。 1.4 原代地质系统 前面所述的酵母杂交系统均是建立在对RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ激活的基础上,整个过程在细胞核内完成。然而许多蛋白要到膜上或胞浆内才表现正常的生物学功能;另外,大多数真核细胞蛋白翻译后要经过加工与修饰,才与其他蛋白质起作用,因此核外双杂交系统应运而生(见图1)。1997年,Aronheim等建立的Sos复原系统(Sos recruitment system,SRS)就是一个典型的代表。该系统中蛋白的相互作用发生在膜上,它通过待测蛋白的相互作用,将Sos蛋白带到细胞膜上,激活附近的Ras蛋白,从而打通Ras信号途径,使Ras途径不通