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健康人群内谷胱甘肽的氧化还原电位测定 水体氧化还原（railol）影响着许多代谢和身体功能。许多生物材料的结构和功能与氧化还原平衡态有关。但体液氧化-还原态的监测指标却是一个至今未能取得共识的悬案, 已被探索的指标包括还原型、氧化型谷胱甘肽的比值 (GSH/GSSG) , NADPH/NADP+, NADH/NAD+, 还原型、氧化型辅酶Q (CoQH2/CoQ) 等, 及体液的氧化-还原电位。本文检测了成都地区青年健康人群中GSH/GSSG的分布状态, 以初步确认GSH/GSSG是否有一相对稳定的范围?是否呈正态或近似正态分布?可否作为一项可用的体液氧化-还原态的监测指标?并为进一步建立GSH/GSSG在健康人群中的正常范围积累基础资料。同时, 对建立的GSH、GSSG测定方法进行了质控检验, 以确认方法的可信度。 1 测定方法 正常人群从健康学生志愿者中募集。年龄22～25岁, 平均年龄为23.5岁。男20人, 女22人。 荧光试剂邻苯二醛 (O-phthaldehyde, OPT, 为瑞士Fluka公司产品) , N-乙基马来酰亚胺 (N-ethylmaleimide, NEM, 为瑞士Fluka公司产品) , GSH和GSSG标准品均为Sigma公司产品。其余均为国产分析纯试剂。所用均为双重蒸馏水。日本岛津RF-510型荧光分光光度仪。德国贺利氏低温离心机。 血浆制备:清晨用肝素抗凝的真空采血管抽取血液5ml, 立即放入离心机中离心10分钟后迅速分离出血浆。取500μl血浆加入等体积0.04M NEM混匀后放置30分钟, 以测定GSSG。再取500μl血浆加入等体积10%偏磷酸 (m/v)除蛋白后进行GSH测定。 红细胞制备:将剩余的红细胞用等体积生理盐水洗涤三次, 将洗涤后的红细胞吸取500μl, 加入等体积蒸馏水充分溶血后加入1mlNEM以及10%偏磷酸除蛋白。放置30分钟后进行GSSG的测定。将洗涤后的红细胞吸取500μl, 加入等体积蒸馏水充分溶血后加入10%偏磷酸除蛋白后进行GSH测定。 将制备好的血浆或红细胞样品分别取100μl, 测定GSH时加入0.1M磷酸氢二钠-0.005M EDTA缓冲液900μl;测定GSSG时加入缓冲液0.1M NaOH 900μl。混匀后分别各取100μl再加入相应缓冲液1.9ml, 加入100μl OPT, 充分混匀放置30分钟后, 在激发波长334.4nm, 发射波长422.4处测荧光强度。 1.6 u3000gsh和gssg标准曲线的绘制和回收率 Eh=Eo+RT/2F ln[ (GSSG) / (GSH)2] 其中, R为气体常数;F为法拉第常数;E0为GSH-GSSH的标准电位值, 以血液pH值7.4为标准, E0为-264mV。根据此公式计算GSH-GSSG的氧化还原电位值。 GSH配制用磷酸缓冲液 (pH8.0) ;GSSG配制缓冲液为0.1M氢氧化钠溶液。GSH和GSSG浓度依次为:0.5、1、2、4、6、8、10ug/ml。标准管加入不同浓度的标准液0.1ml, 空白管加入0.1ml蒸馏水, 各管分别加入相应缓冲液1.9ml, 混匀后加入0.1ml的OPT-甲醇溶液, 混匀后室温下静置30分钟。以空白管调零, 在激发波长334.4nm, 发射波长422.4处测荧光强度, 绘制标准曲线。 在新鲜血浆和红细胞样品和中分别加入GSH和GSSG标准品, 计算其回收率。 在样品加入OPT后5分钟开始测定荧光强度, 并以5分钟为时间间隔, 在加入OPT后60分钟停止测定。观察其荧光强度的变化。 将新鲜血浆和红细胞在-80℃下保存24小时后解冻血浆和红细胞按照新鲜标本步骤进行处理测量。计算出浓度后同新鲜血浆和红细胞内GSH/GSSG进行比较。 采用spss 11.5 for windows 统计软件处理数据。数据用均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示, 统计分析采用t检验, p0.05有统计学意义。 2 结果 2.1 重复性和稳定性 每天新鲜配制GSH和GSSG标准溶液, 各重复测定5次结果。其不同含量的合并变异系数 (CV) 分别为3.25%和2.76%, 显示出良好的重复性, 较稳定。 以均值绘制标准曲线, 见图1。线性关系良好, r值皆大于0.99。其直线回归方程为: Y=49.41195x-3.5377 (GSH) (r=0.997) Y=19.59371x+12.74259 (GSSG) (r=0.998) 2.2 回收率 加入标准品后样品GSH和GSSG的回收率分别为98.1%和97.5%, 回收较完全。表明本方法具有良好的准确度。见表1、表2。 2.3 稳定性试验 在加入OPT后前25分钟荧光强度不稳定, 在30分钟时达到稳定, 其后30分钟内都较为稳定