植物生物技术9_实验五：植物基因组DNA提取-华中农业大学课件.pdfVIP

实验五 植物基因组DNA提取 一、实验目的 ●了解CTAB法提取基因组DNA原理 ●掌握植物基因组DNA提取的基本方法 二、实验原理(CTAB法) 溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分 离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 CTAB提取缓冲液的配方 EDTA Tris-HCl PVP40 CTAB 组份 NaCl β-巯基乙醇 (pH8.0)(pH8.0) 1.4M 2?/V) 终浓度 100 mM20 mM 3?/V)5?/V) 使用前加入 Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质 ,有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除 多糖。 CTAB法流程图： 植物材料 裂解液 酒精沉淀 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 上层溶液 细胞裂解 干燥溶解 三、材料与用品 1.实验材料：植物幼嫩叶片 2.DNA提取器材 研钵、离心机、2mL离心管、移液器(200uL、 20uL、10uL)及配套枪头、65°C水浴锅 3.DNA提取试剂 预冷的异丙醇 四、实验步骤 (一)DNA裂解液配置 DNA裂解液(PH 8.0): 1L 2% 克);2PVP K-30(20克) PH值8.0。 (二)DNA粗提 1.取植物幼嫩叶片于研钵中，加入500ul预热到 65℃的裂解液，充分迅速研磨 管中 五分钟上下轻轻摇动几次 4.拿出后等冷却到室温，加入等体积的氯仿：异戊 醇(24:1),轻轻上下颠倒混匀至溶液成一相。 5.室温12000g离心10分钟 6.用剪宽了的200uL枪头取上清至新管，加入 2/3体积冰冷的(-20℃)异丙醇，轻轻上下颠 倒混匀，这时会出现絮状的DNA沉淀 酒精洗涤沉淀，自然干燥 -20°C保存备用。 (三)DNA纯化 30min 分钟，取上清。 3.重复步骤2 室温放置30min,12000 rpm,离心10分钟。 buffer溶解。 析结果，估计样品DNA分子量。 和A280。计算样品DNA浓度，判断样品浓度和DNA纯度。 五、DNA制备注意事项 1.要得到完整的DNA,在粗提的第6步和纯化的第4步时，可挑 出絮状DNA沉淀，用70??醇洗涤1-2次。 2.步骤3、4、6中要轻轻颠倒试管悬浮沉淀，不可用枪头(尤 其是没剪去枪头尖端)吹打沉淀。 3.各步中吸上清枪头使用前必须粗吸头(微量移液枪的枪头 剪去尖端),避免机械剪切力对DNA链的损伤。 4.为了获得高分子量的DNA,操作中必须防止混匀、抽提及沉 淀时剧烈