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橡胶树gr1基因的克隆及表达分析 橡胶树产于亚马森河流域。作为一种重要的亚热带经济树种，它是目前天然橡胶的唯一经济来源。硫醇类化合物广泛存在于橡胶树胶乳中, 其主要成分为还原型谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 。它在橡胶树排胶和死皮发生过程中发挥重要作用, 能提高黄色体及其他细胞器的稳定性, 防止胶乳原位凝固 (Chrestin等1985) , 死皮橡胶树最初表现为胶乳硫醇含量下降 (校现周1996) 。谷胱甘肽还原酶 (glutathione reductase, GR) (EC 1.8.1.7) 是一种广泛存在于原核和真核生物中的黄素蛋白氧化还原酶。它利用NADPH作为唯一的还原力和电子供体, 催化氧化型谷胱甘肽 (oxidized glutathione, GSSG) 还原为还原型GSH。GR对维持胞内高比率GSH/GSSG有重要作用。作为一种重要的抗氧化酶, GR通过抗坏血酸-谷胱甘肽 (ascorbate-glutathione, As A-GSH) 循环参与清除植物体内多余活性氧 (reactive oxygen species, ROS) , 是还原型As A和GSH再生过程中的关键酶。自1951年首次发现植物GR (Conn和Vennesland 1951) 以来, 人们已对豌豆 (Creissen等1991) 、玉米 (Mahan和Burke 1987) 、拟南芥 (Kubo等1993) 、水稻 (Kaminaka等1998) 、小麦 (Lascano等2001) 和烟草 (Creissen和Mullineaus1995) 等植物GR进行了纯化鉴定及基因克隆。研究发现70%~80%的GR定位在叶绿体, 此外细胞质、线粒体、过氧化物酶体和乙醛酸体中也有GR存在 (Rao和Reddy等2008) 。Rouhier等 (2006) 根据GR蛋白N-末端氨基酸序列特征将GR分为短胞质亚型GR1和长细胞器亚型GR2。GR多以同源二聚体形式存在, 但也有特殊情况, 雷氏衣藻GR以单体形式存在 (Takeda等1993) , 玉米和豌豆GR以异源二聚体形式存在 (Mahan和Burke 1987;Kalt-Torres等1984) 。高等植物GR为一个小的基因家族, 目前在拟南芥 (Kubo等1993) 、烟草 (Creissen和Mullineaus1995) 、豌豆 (Creissen等1991;Stevens等1997) 和豇豆 (Contour-Ansel等2006) 等物种中均发现2个GR, 水稻和杨树中均发现3个GR (Rouhier等2006;Wu等2013) 。GR是一种受逆境胁迫调控表达的酶, 在植物抵御氧化胁迫过程中发挥重要作用 (Schaedle和Bassham 1977) 。干旱 (Contour-Ansel等2006;Khanna-Chopra和Selote 2007) 、高盐 (Wu等2013;Hossain等2011) 、低温 (Huang和Guo 2005;Zhang等2013) 、臭氧 (Kubo等1995) 、重金属 (Panda等2011) 、除草剂 (Romero-Puertas等2006) 等逆境胁迫条件下GR活性或表达量明显增加。 本研究利用RT-PCR和RACE技术扩增并克隆Hb GR1全长c DNA;利用生物信息学软件对该基因及其编码氨基酸的性质和亚细胞定位进行预测;采用real-time PCR技术研究该基因的表达模式。利用p EASY-E1/BL21 (DE3) 系统原核表达Hb GR1蛋白。为进一步研究Hb GR1在橡胶树中的功能提供理论依据, 同时还将促进橡胶树乳管细胞活性氧信号传导研究的发展。 材料和方法 1 胶乳和树皮样品的采集 本研究所用样品均采自中国热带农业科学院试验农场。各组织样品采自1990年定植的橡胶树 (Hevea brasiliensis Muell.Arg.) 品系热研7-33-97。以1997年定植的橡胶树品系PR107为实验树, 参照中华人民共和国农业部 (2006) 农业行业标准采集不同死皮 (tapping panel dryness, TPD) 等级橡胶树胶乳和树皮样品。选用2003年定植的未开割热研7-33-97幼树, 参照Hao和Wu (2000) 方法进行乙烯利 (ET) 和茉莉酸甲酯 (Me JA) 处理, 在处理0、4、8、24、48和72 h后采集胶乳。参照Zhu等 (2010) 和Tang等 (2010) 方法分别进行H2O2和伤害处理, 采集处理后0、6、24和48 h胶乳。以不作任何处理的未开割幼树为对照。 2 实验方法 2.1 清除含dna的dna 参照Xu等 (2010) 方法提取总RNA。RNA中残