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基因表达的半定量PCR检测实验目的： 以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。 实验原理:真核细胞含有三类基本RNA:核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的。DNA进行聚合酶链式反应扩增。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。 PCR技术又称聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。 每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。  ①变性(denaturation)(95°C)；②退火(annealing)；③延伸(elogation)(72°C)图3-1PCR扩增DNA原理示意图 图3-2PCR实验中各种组分的剂量： dNTP常用浓度为20~200pM，不能低于10~15pMo引物浓度一般在0.1~1.0pM。 Mg2+浓度范围通常为0.5~2mM°(3)在100plPCR反应中，1.5~2U的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。 一般反应中的模板数量为102~105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1曲的人基因组DNA,10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA；扩增多拷贝序列时，用量更少。 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10~50mMTris-HCl(20C下pH8.3-8.8)，50mMKCl和适当浓度的Mg2+。Tris-HCl在20C时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8。50mM的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mM的二硫苏糖醇(DDT)或100pg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。 PCR既可以扩增制备全长基因（图3-3），也可以扩增基因片段（图3-4）图3-3PCR扩增全长基因 图3-4PCR扩增基因片段 ExtensionofprimeronmRNARTStepSynthesisofletcDNAstrandAaSTl^iniSPNACigod^TPrimaj.or RT Step SynthesisofletcDNAstrand AaSTl^iniSPNACigod^TPrimaj.orAandomdetarr-sr ScDNA ExtensionofprimeroncDNA0苔ForwardPnmrSynthesisof2ndcDNAstrand 0苔 PCRSteparPCRamplificationofcDNAForwardPrimers1 PCRStep Two-stepRT-PCRAsTsT345Pnmtr 实验材料: .cDNA:实验2获得的cDNA。使用前用紫外分光广度计测定浓度。 .taq酶：5U/pl；附带10xPCRbuffer（w/Mg）：20mMMgSO4,100mMKCl,80mM（NH4）2SO4,100mMTris-HCl,pH9.0,0.5%NP-40。上海申能博彩生物科技有限公司。 上游引物内含KpnI酶切位点（下划线者）；下游引物内含SalI酶切位点。 .小鼠伊actin基因PCR扩增引物（扩增产物156bp）： P-actin-F：5-CATCACTATCGGCAATGAGC-3P-actin-R：5-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3.DNAmarker： .琼脂糖： .漠化乙锭（EB）：10mg/ml水溶液。 .6x凝胶载样缓冲液：0.25%漠芬蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖。 注意：在