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25味中药对小鼠类风湿性关节炎淋巴细胞增殖反应的影响 类风湿性关节炎（ra）是一种非均质性炎症性疾病。这种发病机制与t淋巴结和b细胞激活有关，分泌大量免疫球蛋白并产生免疫反应。因此，类风湿性关节炎的药物治疗应采用抗炎、抗抑制剂的药物治疗，以取得一定的疗效。本研究选择25味具有抗炎、免疫调节及改善微循环功能的单味中药,刺激Ⅱ型胶原纤维诱导的小鼠类风湿性关节炎脾脏淋巴细胞,根据淋巴细胞增殖反应的结果,初步分析25味中药的作用效果。 1 材料表面 1.1 动物 1.2 药品制品鉴定 标准中药对照品:防风、麝香、当归、天麻、丹参、牛膝、白芍、独活、黄芪、人参、川芎、党参、全蝎、羌活、地黄、柴胡、威灵仙、羚羊角、水蛭、蟾蜍、地龙、牛胆粉、紫杉醇、高三尖杉碱、蛇胆汁等,均购自中国药品生物制品鉴定所。制备:取上述中药对照品0.5 g(麝香0.01 g),加蒸馏水40 m L,浸泡20min后加热煮沸,浓缩至10 m L,反复过滤,去药渣,得2 m L澄明溶液,药液终浓度为250μg·μL-1(麝香终浓度为50μg·μL-1).放4℃冰箱保存。 1.3 试剂和药品 Ⅱ型胶原纤维(bovine typeⅡcollagen):Sigma公司产品;福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂,Gibco公司产品;胎牛血清,杭州四季清公司;MTT,上海生物工程公司分装;Sodium Dedecy Su Lfate(SDS):上海生物工程公司;倒置相差显微镜(德国Olympus公司);Model 1550全自动酶标仪(德国BIO-RAD)。 2 方法 2.1 免疫组采用100g型胶原纤维和不完全佐剂 小鼠初次免疫为腹部sc 100μgⅡ型胶原纤维和100μL福氏完全佐剂,3周后再次免疫,使用100μgⅡ型胶原纤维和100μL福氏不完全佐剂;小鼠初次免疫后第5周,脱颈处死,无菌摘除脾脏。 2.2 细胞悬液的制备 无菌摘除的小鼠脾脏在生理盐水中漂洗2次,去除表面的残留血液,剪碎,无菌挤压过200目网,同时用NH4Cl 2 m L冲洗,去除红细胞,离心1 500 r·min-110 min,去上清,加2m L含10%胎牛血清的DMEM培养液,用0.5%的台盼蓝染色计数,制成2×105个/m L的细胞悬液。 2.3 mtt法对脾淋巴结的克隆 2.3.1 中药提取液和mtt液的制备 取96孔细胞培养板,每孔加0.1 m L PBS含0.5μgⅡ型胶原纤维,-4℃保存12 h。吸去板中液体,每孔用200μL含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加0.1 m L脾脏淋巴细胞的培养液,6 h后每孔加入2μL的中药提取液进行刺激,在37℃5%CO2培养箱中培养12 h。吸去培养液,每孔加0.1 m L PBS和10μL MTT溶液(5 mg·m L-1),培养箱中培养2 h。每孔加0.1 m L 10%SDS(含10 mmol·L-1盐酸),置酶联检测仪中测定吸光度(A)值,检测波长570 nm,参考波长630 nm。设置调零孔(培养液、MTT、SDS),阴性对照孔(细胞、培养液、MTT、SDS),中药刺激孔(中药提取液、细胞、培养液、MTT、SDS),每组设定6复孔。 2.3.2 %co培养箱 取96孔细胞培养板,每孔直接加0.1m L脾脏淋巴细胞的培养液,在37℃5%CO2培养箱中培养12 h。每孔加入2μL的中药提取液进行刺激,培养箱中培养72 h,吸去培养液,每孔加0.1m L PBS和10μL MTT溶液(5 mg·m L-1),培养箱中培养4 h,余下操作步骤同上。 2.3.3 统计分析 数据以表示,应用SPSS17.0软件进行分析,中药刺激孔与阴性对照孔的A值采用配对样本t检验,P0.05为差异有统计学意义。 3 结果 3.1 阴性对照组和阴性对照组的为抑制,其为促进,二者的为促进,二者的为促进,二者的为促进,二者的为促进,其复合化的方法为 25味中药提取液刺激脾脏淋巴细胞,酶联检测A如表1。中药刺激孔A值与阴性对照孔A进行比较,小于阴性对照组的为抑制,大于阴性对照组的为促进。根据A的大小将促进程度分为轻微(0.066~0.200)、中等(0.200~0.400)、较强(0.400),结果表明,羌活对淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用,而川芎、全蝎、丹参则具有较强的促进作用,结果详见表2。 3.2 中药作用结果 在中药刺激后培养时间明显增长,需要72 h,而且加入MTT溶液后的培养时间也要延长2h。酶联检测A如表3。中药刺激孔A与阴性对照孔A值进行比较,小于阴性对照组的为抑制,大于阴性对照组的为促进,根据A的大小将促进分为轻微(0.016~0.500)、中等(0.500~1.000)、较强(1.000),结果麝香、白芍、羌活、牛膝对淋巴细胞增殖反应具有明显的抑制