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拉曼光谱在血红蛋白研究中的应用 血红蛋白结构与功能研究中拉曼光谱的应用 血液不仅具有将氧气分配到身体各部分的重要生理功能，而且还具有调节ph值的能力。调整一氧化氮水平，参与免疫反应。尽管一直作为描述蛋白质结构与功能关系的重要范例,但是当前对血红蛋白的认识仍滞后于大量临床病例诊治的需求［１］。同时,鉴于血液安全保障形势日益严峻,血红蛋白氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs)作为红细胞代用品的主要类型,其研制为血红蛋白结构和功能的认识不断提出新要求［２］。 拉曼光谱是一种与分子或晶格振动相关的光子非弹性散射光谱,可用于分子结构分析。在血红蛋白结构与功能研究中,拉曼光谱具有三方面突出优势:第一,样品准备简单,避免稀释液等对血红蛋白结构的影响;第二,可进行实时、原位检测,使在体或无损检测成为可能;第三,光谱信息量大,可同时分析不同化学键的振动方式。1972年Strekas和Spiro的工作揭开了拉曼光谱研究血红蛋白结构的新篇章［３］。近年来,血红蛋白中血红素平面及其与铁离子轴向配体键的拉曼光谱归属的深入研究,不仅为揭示血红蛋白反应动力学及相关机制奠定基础,还为病变血红蛋白的检测与诊断提供了实验依据,并可定量评估血氧饱和度和高铁血红蛋白含量。本文将从这些方面综述血红蛋白拉曼光谱的研究进展。 1 血红蛋白拉曼光谱峰位归属 通过拉曼光谱峰位的归属分析可以得到官能团、化学键和电子密度等分子结构及其变化的信息［４］。由于血红素拉曼散射截面相对较大,因此血红蛋白的拉曼光谱主要反映血红素振动特征［５］。研究者们通过同位素标记血红素中铁离子、吡咯环中氮原子、次甲基中氢原子以及改变其周围取代基,结合血红蛋白拉曼光谱峰频率和强度变化,确定了血红蛋白拉曼光谱峰的归属。 Abe等将对称性为D４ｈ血红素分子的核心卟啉环结构进行了简正坐标分析,为血红蛋白的拉曼光谱峰位归属提供了依据,其结果经整理列于表1中［６］。血红蛋白拉曼光谱受血红素环内电子密度、血红素中心尺寸(Heme core size)、铁离子自旋态以及铁离子-血红素环表面距离等影响发生变化。高频区(1 200~1 700cm－１)反映血红素环骨架振动模式,是血红素结构变化的敏感谱带;低频区(200~700cm－１)反映血红素平面和铁离子轴向配体键的微小变形(图1)［７］。 1.1 生物资本的热重wbf-甲基-n原子间关系及选择 血红素环骨架振动模式可分为Band Ⅰ-Ⅵ(表2)。BandⅠ为血红素环内电子密度敏感谱带,其波数范围为1 340~1 390cm－１,是血红素氧化还原态的标志谱带,且不受自旋态影响,与四个吡咯环的相同呼吸振动有关,很大程度上归属于Cα—N的对称拉伸。当Fe的氧化态降低时,反馈到卟啉π＊轨道d电子随之增加,卟啉π 电子密度降低,C—N伸缩振动频率降低,拉曼光谱中Band Ⅰ频率降低［６］。例如高自旋HbⅢF(氧化型Hb氟化物)和低自旋HbⅢCN(氧化型Hb氰化物)的BandⅠ频率出现在1 373cm－１,高自旋的de-oxyHbⅡ(还原型脱氧Hb)的Band Ⅰ 频率出现在1 357cm－１［８］。 出现在1 470~1 650cm－１的拉曼光谱峰反映了血红素中心与吡咯环N原子之间的距离。根据极化情况不同,该区段分为BandⅡ-Ⅵ,为血红素中心尺寸相关振动谱带。其中,极化、去极化及反常极化是由拉曼光谱中的退偏比(ρ１)决定的,ρ１1/3为极化,ρ１=3/4 为去极化,ρ１3/4 为反常极化［３，６］。这几种振动带是铁离子自旋态敏感谱带,受血红素环内电子密度影响小,主要受次甲基键伸缩振动的影响。BandⅡ,Ⅳ和Ⅴ与次甲基键(Cα—Cｍ和Cα—Cβ)拉伸模式有关,BandⅥ与Cβ—Cβ拉伸模式有关。当Fe离子由低自旋态变为高自旋态,Fe与吡咯环N原子之间距离增大,键长增长,血红素中心尺寸增大,dx２—y２反键轨道电子密度增高,Band Ⅱ,Ⅳ和Ⅴ频率左移［７］。已有研究提出Band Ⅱ-Ⅵ的拉曼频率与血红素中心尺寸大小呈线性关系［９］,即νｉ= Kｉ(Aｉ-RＣｔ—Ｎ),RＣｔ—Ｎ为血红素中心尺寸大小,表3为Kｉ和Aｉ测定参数。 1.2 fe—Fe-配体振动相关谱带 在血红蛋白拉曼光谱中,Fe-配体振动相关拉曼谱带出现在400~650cm－１,这一区段拉曼频率与连接铁离子的配体、Fe-配体键相关。Chottard等［１０］对一氧化氮血红蛋白拉曼光谱的研究认为549cm－１峰归属于Fe—NO拉伸振动,该轴振动的拉曼强度来自于卟啉环Ⅱ电子向Fe—NO部分的离域。Yu等［１１］发现453,412,500和574cm－１分别归属于Fe(Ⅲ)—CN拉伸模式、Fe(Ⅲ )—C—N弯曲振动模式、Fe(Ⅱ)—CO拉伸模式和Fe(Ⅱ )—C—O弯曲振