雷公藤甲素对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响.docxVIP

雷公藤甲素对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响 雷公藤又名黄藤、黄藤、黄蜡藤、断肠草，属于卫矛科雷公藤，具有全株毒性。根据在中国医学经典《洗喜记》中列出的老鼠草，它被称为雷公藤。雷公藤有清热解毒,祛风除湿、消肿止痛、通经活络、杀虫止血等功效。现代药理及临床研究证实,雷公藤具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制及抗生育等作用。但由于其治疗量与中毒量比较接近,疗效大小又与剂量相关,所以,屡见使用雷公藤制剂过量或时间过长而发生中毒的病例报道,亦有服用过量而中毒死亡者。 雷公藤甲素(雷公藤内酯醇,Triptolide,TP)系由雷公藤根中提取分离的有效单体,是一种有三个环氧基团以及一个α,β-不饱和五元内酯环结构的构型独特的松香烷型二萜化合物,其化学结构式与糖皮质激素相似。TP抗炎、免疫抑制作用及部分毒副作用的产生均由其特定的化学结构式所决定,其作用机制之一,与其对下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamicpituitary-adrenal axis,HPAA)的影响有关,以往的研究主要集中在对肾上腺的质量、大小和Vit C含量检测,以及光镜下HE染色的组织结构变化观察。本研究采用放射免疫分析方法检测大鼠血浆皮质醇(cortisol,COR)、促肾上腺皮质激素(adrencocorticotropic hormone,ACTH)含量,ELISA法测定血浆促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)含量,免疫组化法检测大鼠垂体中ACTH表达水平,结合光镜观察肾上腺皮质束状带组织结构及电镜观察其超微结构改变,多层面、多角度地从形态和功能两方面综合评价TP对大鼠HPAA的影响。 1 材料和方法 1.1 cor和acth检测 TP,纯度99.3%(北京美迪克斯生物技术有限公司);醋酸泼尼松(山东新华制药股份有限公司);COR放射免疫分析药盒、ACTH放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所);CRH ELISA检测试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司);兔抗人ACTH抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司)。 1.2 自动免疫流量计、kc-2432标准 JEM-1230型透射电镜(日本电子株式会社),GC-911型自动γ免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司),KDC-2042低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司),CMIAS病理图像分析系统4.10(北京麦克奥迪图像技术有限公司)。 1.3 动物组和药物 1.3.1 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠30只,体质量160~180 g,由浙江省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(浙)2003-0001。将30只大鼠随机分为空白对照组、泼尼松组和TP组,每组10只。 1.3.2 灌服、被调剂、动物的药剂量调整单次用药 将TP和泼尼松分别用2%丙二醇配成混合溶液,4℃保存。大鼠适应性喂养1周后连续给药,每组给药浓度不同,均灌服等体积溶液(2 m L/kg),每日两次。给药量:空白对照组为2%丙二醇2 m L/kg,泼尼松组为2 mg/kg,TP组为20μg/kg。实验期间,动物自由饮水进食。每3 d称体质量一次,以调整用药剂量。室温25℃,自然光线。连续灌胃7周后断头处死大鼠。 1.4 实验方法 1.4.1 固血固蛋白的制备 大鼠断头取血(1min内完成),分别注入含肝素抗凝剂的试管和含10%EDTA二钠30μL的试管中,混匀,4℃,以离心半径113 mm,3 500 r/min,离心15 min,分离血浆。按试剂盒说明书操作步骤进行测定。 1.4.2 工会法测定的crh含量 大鼠快速断头取血(1 min内完成),分别注入含肝素抗凝剂的试管中,按试剂盒说明书操作步骤进行测定。 1.4.3 双侧肾上腺素质量 实验大鼠适应性喂养1周后,称实验前体质量;连续灌胃7周后处死大鼠前,称实验后体质量;取出肾上腺后用电子分析天平称双侧肾上腺质量。按下列公式计算器官系数:器官系数=器官质量(g)/实验后体质量(kg)。 1.4.4 肾上腺he染色 将左侧肾上腺以无冰醋酸的Bouin氏固定液固定24 h。取出固定液中肾上腺标本,常规脱水、石蜡包埋、制片,光学显微镜观察。 1.4.5 透射电镜观察 将右侧肾上腺在束状带位置取1 mm×1 mm×1 mm大小组织固定于2.5%戊二醛磷酸钠缓冲液中,4℃冰箱保存4 h,常规脱水、浸透,包埋聚合,切片,透射电镜观察。 1.4.6 免疫组化染色 取出大鼠脑垂体,放入无冰醋酸的Bouin氏固定液中固定24 h。取出固定液中脑垂体标本,常规脱水、石蜡包埋。脑组织做冠状面连续切片,厚度约5μm,经黏片剂处理过的载玻片捞片,置于60℃烤箱烘烤1 h。相邻切片行HE及免疫组化染色。切片常规脱蜡至水,30%H2O