中药注射剂对头孢他啶抗大肠埃希菌内毒素的影响.docxVIP

中药注射剂对头孢他啶抗大肠埃希菌内毒素的影响 内毒素是许多细胞因子的诱导剂，可以触发等级炎症反应。它的成分是革兰氏阴性细菌细胞膜外膜的脂肪性成分。有人认为,革兰阴性细菌所致的脓毒血症至今死亡率居高不下,是由于抗菌药物在杀灭细菌的同时伴随着内毒素的释放,产生高内毒素血症所致。我们据此设计实验,探讨头孢他啶在临床用量下对细菌内毒素产生的影响。寻找有效、低毒的抗内毒素药物一直是多年来的研究热点,据文献报道,具有清热解毒作用的中药及其注射剂有抗内毒素作用,本文模拟临床用药剂量、顺序及间隔时间,体外实验考察了我院常用清热解毒中药注射剂清开灵、双黄连和喜炎平分别与头孢他啶联合应用时对大肠埃希菌产生内毒素的影响,旨为临床内毒素血症的治疗提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料表面 (1) 病毒 大肠埃希菌ATCC25922,由河北医科大学第一医院检验科提供。 (2) 培养基 改良型RPMI 1640(海克隆生物化学制品有限公司,批号NSG0059)。 (3) 针剂、注射液 头孢他啶(每支0.5g,石药集团中诺药业有限公司,批;清开灵注射液(每支10ml,河北神威药业有限公司,批;双黄连粉针剂(每支600mg,哈药集团中药二厂,批号0611235);喜炎平注射液(每支50mg,江西青峰药业有限公司,批号0080313);细菌内毒素工作标准品(每支140Eu,中国药品生物制品检定所,批号150601-200758);内毒素测定试剂盒(湛江安度斯生物公司,批号0609271)。 (4) 仪器 B600A型低速离心机(白洋离心机厂);BET-32B细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂)。 1.2 方法 (1) 细菌溶液的制备 细菌接种于无抗生素的RPMI 1640培养液中,于37℃水浴中培养16h,作为细菌母液。 (2) 对大肠杆菌埃希菌的mic 采用2倍稀释法于96孔板中测定头孢他啶在空白液、清开灵(500倍稀释液)、双黄连(0.36mg/ml)及喜炎平(0.01mg/ml)中对大肠埃希菌的MIC。终菌量为5×106CFU/ml左右,37℃保温箱培养20h。 (3) 菌种制备及培养 细菌母液临用前配成约1×108CFU/ml,再分别以RPMI 1640培养液稀释成所需浓度备用。取5ml离心管若干,各加入2ml RPMI 1640培养液,37℃水浴预热10min,加入备用菌液50μl,使菌浓度分别为2.5×105、2.5×104、2.5×103、2.5×102及2.5×10CFU/ml,水浴培养3.5h,使细菌处于对数生长期。每个浓度的菌液组各设2组(对照组和头孢他啶组),各加入RPMI 1640培养液或头孢他啶液100μl,使头孢他啶终浓度为50×MIC(6.25μg/ml)。继续水浴培养3.5h,离心取上清液,-20℃保存备用。按试剂盒说明方法测定RPMI 1640培养液内毒素基底值及各组内毒素含量。 (4) 中药注射液的制备 菌液制备如上述。取5ml离心管若干,加入2ml RPMI 1640培养液,37℃水浴预热10min,加入备用菌液50μl,使终菌浓度为2.5×102CFU/ml,水浴培养3.5h,中药注射剂与终浓度为50×MIC的头孢他啶液各100μl先后加入(头孢他啶液在中药注射剂加入之前或之后1.0h加入),中药注射剂的终浓度为:清开灵500倍稀释液,双黄连0.36mg/ml及喜炎平0.01mg/ml。继续水浴培养3.0h,离心取上清液,-20℃保存备用。内毒素测定方法同上。 (5) 统计分析 数据以xˉ±s表示,组间采用t检验进行显著性分析。 2 结果 2.1 清开灵和喜炎平制剂 头孢他啶的MIC为0.125μg/ml,清开灵和喜炎平注射剂对其MIC值无影响,但双黄连注射剂可使头孢他啶的MIC增至32μg/ml以上。 2.2 内毒素的测定 RPMI 1640培养液内毒素基底值为零,培养液对内毒素测定没有影响。 在菌浓度较高时,50×MIC头孢他啶对大肠埃希菌内毒素的生成有诱导作用;菌浓度较低时可显著降低内毒素含量(表1)。 2.3 降低内毒素的作用 中药注射剂与头孢他啶的加入顺序对内毒素含量有影响,当中药注射剂晚于头孢他啶1h加入时,清开灵和喜炎平均可显著降低内毒素含量,后者效果好于前者,但双黄连未显示出降低内毒素的作用。当中药注射剂早于头孢他啶1h加入时,3种中药注射剂均未显示其抗内毒素作用(表2)。 3 新生儿血液中抗菌药物分布 抗生素对细菌内毒素产生的影响与多种因素有关,如青霉素结合蛋白(PBPs)的种类、抗生素的浓度等。头孢他啶、头孢噻肟等抗生素在低浓度时与PBP-3结合,使细菌成细丝状,有较大表面积,可产生较多内毒素;在高浓度时与PBP-1结合,快速杀死细菌,使之溶解,产生较少量内