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侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠脑psd-95和shank1表达的影响 中风和阿尔茨海默病（ad）是老年人常见的神经退行性疾病。散发性AD的受累脑区,神经细胞胰岛素信号传导系统功能障碍,导致能量代谢紊乱是其明显特征。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是亚硝基脲衍生物,脑室内小剂量注射STZ可拮抗脑内胰岛素受体的酪氨酸酶活性,导致胰岛素信号传导障碍,引起大鼠脑持久的葡萄糖代谢紊乱和能量生成受阻,海马乙酰胆碱转移酶活性降低和氧化应激反应以及学习和记忆下降。此模型可以模拟 AD脑的进行性能量代谢紊乱和认知功能障碍。 阿尔茨海默病患者的记忆障碍是早期突出表现,其程度与突触数目的丢失及突触功能的丧失密切相关。脑内Aβ蛋白的聚集可破坏突触的完整性和可塑性,使突触功能丧失。已证实脑室注射STZ可引起脑内Aβ表达增加。富含脯氨酸的突触相关蛋白——突触后致密区蛋白-95(postsynaptic density 95,PSD-95)和Shank1蛋白是突触后致密区内核心的构架蛋白,在维持突触正常功能和可塑性方面有重要作用。本研究从大鼠海马突触相关蛋白PSD-95和Shank1蛋白表达的变化来探讨脑室注射STZ对突触功能的影响。 材料和方法 1. 实验动物及设备 雄性Wistar大鼠30只,320～350g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2002-0003,饲养于首都医科大学宣武医院实验动物室SPF级鼠房。根据SPSS统计软件产生的随机数字将大鼠随机分为STZ造模组和对照组,每组各15只。自由进食、饮水,昼夜节律光照。 2. 人工瞳神经口式脑立体定位 造模组大鼠禁食不禁水12h,分别于第1d、3d侧脑室注射STZ,按3mg/kg用量,以25g/L溶于人工脑脊液(CSF)中,每只大鼠20μl(0.5mg)/每侧脑室。对照组大鼠在相同条件下脑室注射同等体积的人工脑脊液。手术方法:大鼠称重,以10%水合氯醛腹腔麻醉(300mg/kg);头部皮肤备皮、消毒,沿中线作1cm左右长的矢状切口,暴露颅骨,将大鼠固定于立体定位仪上,参照大鼠脑立体定位图谱及文献,在前囟后0.8mm、中线水平旁开1.5mm处,左右各定位一点;在定位点处钻直径约0.8mm的小孔,用微量加样器在左右脑室各缓慢注射20μl药液,垂直进针,深度为3.6mm;注药后留针5min左右,缓慢拔针,皮肤缝合消毒。术后常规饲养21d。 3. 血液中的糖含量 分别于术前和术后(21d)尾静脉采血,微量血糖仪(强生公司)测定外周血糖。 4. 大鼠脑的固定 术后21d,每组取10只大鼠,动物麻醉(方法及剂量同前),打开胸、腹腔,充分暴露心脏和肝脏。剪开左侧心尖部,插导管于左心室并固定,同时剪开右心耳。快速灌注生理盐水250ml左右,至肝脏完全变白,右心耳流出澄清液体后,换用4%多聚甲醛固定液先快速再缓慢灌注 100ml左右,至大鼠肝脏变硬,肢体僵直,即固定完成。断头,完整取出鼠脑后投入含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中固定至脑下沉。-20℃恒冷箱冠状连续切片,片厚35μm。 5. 免疫总体生物素-pap的制备 免疫组织化学漂浮染色法,切片以0.01mol/L PBS洗5min×3次,用3%H2O2室温孵育 30min;PBS洗5min×3次,8%～10%羊血清封闭孵育30min,吸出血清,分别加入稀释好的一抗(宣武医院多肽室提供,兔来源):PSD-95(1∶1 000)和Shank1(1∶1 500),4℃孵育过夜;PBS洗5min×3次。加生物素标记的抗兔二抗(北京中山试剂公司,1∶300稀释),室温孵育1h;PBS洗5min×3次,加HRP标记的PAP复合物(北京中山试剂公司,1∶300稀释),室温孵育1h;PBS洗5min×3次,DAB显色,自来水终止反应,裱片,切片经脱水、透明、封片后光镜下观察。 阴性对照:用正常血清代替一抗,在相同条件下进行免疫组织化学染色,结果为阴性。 6. 免疫印迹分析 每组取5只大鼠,麻醉后冰上快速断头剥离海马,加入组织裂解液[50mmol/L Tris-HCl缓冲液pH7.4,10g/L 苯甲基磺酰氟(phenylmenthylsulfonyl fluoride, PMSF),0.5mol/L 乙二胺四乙酸(ethylen ediamine tetraacetic acid, EDTA)]匀浆,12 000r/min 4℃离心30min,用Lowry法蛋白质定量。按《分子克隆技术》方法进行免疫沉淀和免疫印迹分析,AP法显色。标准分子量蛋白质为Invitrogen公司产品;PSD-95(1∶2 000)、Shank1(1∶2 000)抗体均由宣武医院多肽室提供。每组重复3次。 7. 统计处理 采用SPSS10.0统计软件,数据以均值±标