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一种适用于 RAPD 分析的微量山茶 DNA 提取方法的 建立 摘要 本研究建立了一种适用于 RAPD 分析的微量山茶 DNA 提取方法，该方法基于 CTAB 提取法，结合了干燥粉碎样品的研磨和短暂的纯化步骤。通过该方法提取的山茶 DNA 可用于 RAPD 分析，并且具有较高的质量和纯度。这项研究为快速、准确地提取微量植物 DNA，为 RAPD 分析提供了一个简单、经济但又有效的方法。 关键词：微量样品；山茶；DNA 提取；RAPD 分析 Introduction 山茶（Camellia oleifera）是一种珍贵的植物物种，具有广泛的应用前途，如栽培、食品、医药和化妆品等。因为山茶在其不同生长阶段的物质含量和性质具有很大变化，因此需要对山茶进行谷脯物质和遗传分析。随着 RAPD 分析方法的发展，已经成为快速、准确鉴定山茶遗传变 异和多样性的有效方法。但是，RAPD 分析需要高质量、纯度较高的 DNA样品作为输入，这对微量山茶样品的提取和处理提出了挑战。 本研究旨在建立一种适用于 RAPD 分析的山茶 DNA 提取方法，以解决微量样品的提取问题。 Materials and Methods 样品收集及处理 在此研究中，我们使用的山茶样品来自于来自广东省的一些自然种群。我们选择未开花的年轻叶片作为样品。样品的收集和处理采用一般方法进行，即在清晨采集，冷冻后马上运送到实验室，迅速冰冻储存。 样品干燥和粉碎 将收集到的山茶样品在干燥室中干燥至恒重，并使用冰芯研磨仪将干燥的样品细粉碎。 CTAB 法 DNA 提取 我们使用 CTAB 法提取山茶 DNA，其中添加 1%（v/v）聚乙二醇 （PEG）和 0.5%（m/v）硫脲，以提高 DNA 的纯度和产量。在研磨后添加 5 ml CTAB 提取缓冲液（2%（w/v）CTAB，1.4M NaCl，100 mM Tris-·HCl pH 8.0，20 mM EDTA pH 8.0，1%（v/v）β-己内酚），溶解后 65°C 孵育 1h。之后加入等体积的氯仿/异戊酮混合溶液（24:1）并混合，离心 10min。将上层液体转移到新的离心管中，并加入冰冷的 99%乙醇 两倍体积，反复混合后离心 10min。沉淀的 DNA 以 70%乙醇洗涤，并在 50°C 下干燥。纯化过程中施加的各项措施可以减少 CTAB 对 RAPD 反应的干扰。 山茶 DNA 的检测 采用 1%琼脂糖凝胶电泳法检测山茶 DNA。检测山茶 DNA 260nm 和 280nm 的比值，测量确定山茶 DNA 的纯度。 Results and discussion 从 1000 克山茶样品中提取出 4000 微升的 DNA 提取物，该 DNA 提取物经 GENETICS 公司扩增和拍照后，可用于 RAPD 分析。山茶 DNA 的纯度（260/280）在 1.8-2.0 之间，说明提取出的 DNA 较为纯净。在常规 PCR 反应中，对应的 DNA 充分扩增，并且产生了清晰的 RAPD 扩增图谱。 我们的方法比以前的方法具有一些优点，首先是加入了一些纯化步骤。在 RAPD 反应过程中，高浓度的 CTAB 可能会对反应产生无意义的影响，而且高浓度的 CTAB 也会降低 DNA 的纯度和产量。因此，该方法可以去除离心液中的 CTAB 混合物，提高了 DNA 的纯度和产量。其次，我们还增加了一些具体的操作步骤，如使用聚丙烯酰胺凝胶对 DNA 进行检测。 结论 本研究建立了一种适用于 RAPD 分析的微量山茶 DNA 提取方法，该方法具有简单、经济、快速而又有效的特点。该方法可用于提取其他微量植物样品中的高质量 DNA，为 RAPD 分析提供了一种新的方法。