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乳制品中五种核苷酸的测定 新生儿配方奶粉中的核苷酸 磷酸是由含有氮的碱性化合物、糖或脱氧核糖和磷酸组成的。这是构成氨基酸的成分。核苷酸在人体内广泛分布, 具有多种生物学功能。细胞内的游离核苷酸可以为很多生化反应提供能量。核苷酸是组成生命的核酸大分子的基本结构单位, 在代谢上起了极为重要的作用, 同时还是DNA和RNA的前体以及它们的分解产物, 它几乎参与细胞的所有代谢过程, 为很多生化反应提供了能量。涉及核苷酸的研究对象非常广泛, 包括细胞、矿物质、食品、血浆等领域。一些临床上的研究发现, 添加核苷酸的婴儿配方奶粉, 可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。 目前婴幼儿配方奶粉中主要添加的核苷酸主要有5种:胞嘧啶核苷酸 (Cytidine monophosphate, CMP) ;尿嘧啶核苷酸 (Uridine monophosphate, UMP) ;腺嘌呤核苷酸 (Adenosine monophosphate, AMP) ;鸟嘌呤核苷酸 (Guanosine monophosphate, GMP) ;次黄嘌呤核苷酸 (Inosine monophosphate, IMP, 肌苷酸)。在现行的国家相应标准中, GB 14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中规定, 核苷酸的允许使用量为0.12 g/kg~0.58 g/kg (以核苷酸总量计) , 但其检测方法标准并未建立。为保障国民健康, 适应进出口检测工作的需求, 因此建立了本检测方法。 1 材料和方法 1.1 超声提取法 高效液相色谱 (带DAD检测器) , 紫外可见分光光度计, p H计, 超声波提取仪等。 40%的四丁基氢氧化铵溶液 (购自sigma公司) , 高氯酸, 磷酸二氢钾, 磷酸氢二钾, 磷酸, 甲醇 (色谱纯) 。 1.2 标准物质 5’-胞苷酸, 5’-尿苷酸, 5’-鸟苷酸二钠盐, 5’-肌苷酸, 5’-一水腺苷酸, 均购自sigma公司。 1.3 标准溶液的配制 称取5 g (精确至0.001 g) 样品于50 m L具塞试管中, 加水约30 m L充分溶解, 超声提取10min。加入3 m L 13%的高氯酸水溶液, 摇匀后静置30 min, 间歇震荡。用蒸馏水定容至50 m L后过滤。取滤液20 m L, 用2%的氢氧化钠溶液调节p H至6.5~7.0之间 (如果p H高出范围, 用13%高氯酸溶液调回) , 用蒸馏水定容至25m L后, 0.45um滤膜过滤至液相进样瓶备用。 分别称取10.0 mg的核苷酸标准品, 用水定容至100 m L, 即为五种标准品的储备液;分别取1 m L储备液定容至10 m L, 得到浓度为10μg/m L的标准品溶液。将五种标准品溶液分别于紫外可见分光光度计进行扫描, 得到400~190 nm下标准品的光谱图, 从而得到五种标准品的最大吸收波长。 1.4 丁基氢氧化铵总ph的检测 色谱柱:SUPELCOSIL LC-18-T色谱柱 (粒径5μm, 250 mm×4.6 mm) 。检测波长:254nm、278nm。流动相:含0.75m L四丁基氢氧化铵溶液的磷酸二氢钾水溶液 (10 mmol/L) , 用1%磷酸调p H至4.5;甲醇。柱温:35℃。进样量:10μL。 2 结果与讨论 2.1 亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀法 在实验中, 分别使用了13%高氯酸、亚铁氰化钾/乙酸锌、冰乙酸作为沉淀剂。经过实验, 冰乙酸对于有些样品中的蛋白质无法沉淀;采用亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀, 会影响核苷酸的分离;而采用13%高氯酸则能很好的沉淀蛋白, 并且不会影响核苷酸的分离。 2.2 柱柱及柱柱的选择 在实验中, 分别使用了SUPELCOSIL LC-18-T色谱柱和ZORBAX SB-C18色谱柱进行分离。结果如图1所示, 使用SB-C18柱时, 含量低、保留时间接近的GMP和IMP两个峰均有变形, 并且CMP与其附近的杂质峰分离度低;使用SUPELCOSIL LC-18-T色谱柱时, 五个峰均有很好的峰型, 但UMP与其附近的杂质峰有时分不开, 这可通过改变其它条件进一步优化, 因此选择SUPELCOSIL LC-18-T色谱柱。 2.3 流动相及流速 在实验中, 为了延长核苷酸的保留时间, 在流动相中加入了离子对试剂四丁基氢氧化铵。由于离子对试剂与色谱柱的固定相结合需要较长的平衡时间, 且有机相比例的增减对离子对试剂有很大的影响, 因此采用等度洗脱。 流动相中甲醇的比例对核苷酸的分离有很大的影响。如图所示, 加入5%的甲醇时, UMP前有很大的杂质峰, 不易分开, 并且AMP在65 min左右才出峰, 分析时间较长;甲醇的比例为7%时, UMP出峰在杂质峰前, AMP出峰时间约为25 min, 分析时