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中华鳖精子头发育超微结构的变化 动物的超微结构研究主要集中在牛奶和昆虫上，其他动物的实验报告相对较少。不同种类的动物,其精子发生的形态变化过程存在差异,精子细胞的变态机制争议更大。关于爬行动物精子形成的研究,有鳞目的蜥蜴类和蛇类已有报道,但龟鳖目精子发生的变态过程描述很少。中华鳖是我国养殖最广泛的水生爬行动物,具有重要的经济和药用价值,尤其最近有人开始了中华鳖的繁殖生物技术的研究,需要对中华鳖的精子特性和生殖细胞的形成过程进行详细诠释。精子头部主要包括细胞核和顶体,是精子结构和功能的最重要部分。本实验室曾观察了中华鳖成熟精子的结构特性,发现中华鳖的精子形态与其他爬行类差异明显。本文进一步应用透射电镜技术,观测了中华鳖精子头部形成过程的超微变化规律,并与其他动物进行比较,为深入研究动物精子发生的变态机理和中华鳖的生殖生物学特性提供形态基础。 1 睾丸的制备和重建 2005年9月25日,10只中华鳖购自南京市惠民桥水产市场,均为人工池塘养殖2—3龄的性成熟雄鳖,650—800g / 只。此期均在繁殖季节,健康状态良好,买来后立即宰杀,掀开腹甲,每只任选一侧睾丸切取组织块。将睾丸组织修切成1mm3小块,固定于2.5%戊二醛PBS液中,4℃过夜,PBS洗涤,1%锇酸后固定1h,上行梯度酒精脱水,至100%乙醇后,丙酮置换,Epon812包埋。LKB切片机超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,JEM-100CXII型透射电镜观察并拍照。 2 结果 2.1 均匀微细的粒度 中华鳖精子细胞核呈饱满的圆球形,位于细胞中央,染色质为均匀细小的颗粒状(图版I : 1,2),着色淡,核大小约为2.8μm × 3μm。胞质内圆形线粒体稀少,线粒体嵴为板状。滑面内质网为平行排列的扁囊状(图版Ⅰ: 1)。 2.2 第期核型核的发育与发育 精子头部的形成过程的形态变化主要包括顶体的形成、细胞核浓缩以及细胞核拉长变细。根据不同阶段的主要形态事件,本实验将中华鳖精子头部的形成过程分为5个连续时期: 第Ⅰ期精子细胞开始变态时,由高尔基复合体分泌形成的前顶体泡移动到细胞核一侧(图版Ⅰ:1),泡内含有非均质状物。前顶体泡同侧的细胞核膜变平坦(图版Ⅰ:1),并与前顶体泡接近。随后,平坦的核膜逐渐向内凹陷,前顶体泡不断变大,并嵌于核膜凹陷内(图版Ⅰ: 2)。前顶体泡内变得清亮,高尔基复合体始终位于其附近。胞核凹陷稍加深,但最终呈一浅窝(图版Ⅰ: 2—6)。细胞核开始向精子细胞一侧移动,移动时前顶体泡在前端。同时圆形的细胞核开始变形,呈前端窄小后端宽大的梨形(图版Ⅰ:3,4)。前顶体泡底部中央出现一个电子致密的小颗粒,为顶体颗粒(图版Ⅰ:4)。顶体底部与细胞核之间产生一薄层纤维物质层(图版Ⅰ:4),此纤维物质层不断增厚并致密(图版Ⅰ: 5—8)。高倍电镜下,于纤维物质层胞核一侧的中央,正对着顶体颗粒有一更小的顶体下颗粒(图版Ⅰ:5)。随后,顶体下颗粒消失,但核前端中央继而出现一条短的致密带(图版Ⅰ:6)。致密带逐渐向后延长(图版Ⅰ:8),并可增至2—4条(图版Ⅱ:9),将发育成为核内小管。第I期细胞核染色质与精子细胞核一样,一直呈均匀细小的淡染颗粒(图版Ⅰ:3,4),此时核大小约2.6μm×3μm 。 第Ⅱ期细胞核凹窝向外隆突(图版Ⅰ:7),推动并顶压前顶体泡由圆形逐渐变扁,此过程由凹窝中央波及周围,最终使得顶体囊覆盖于核前端(图版Ⅰ:8),内外两层顶体膜平行排列,形成顶体帽。同时,顶体颗粒在扁囊状的顶体内弥散开来,使原来清亮的前顶体泡变成中等电子致密物(图版Ⅰ: 7,8, 图版Ⅱ:13,15)。细胞核进一步端移和拉长。顶体帽外膜与精子细胞膜接近,而顶体帽内膜底部与细胞核之间的纤维物质层增厚且变得更致密(图版Ⅰ:8, 图版Ⅱ:9),将来形成顶体下锥(图版Ⅱ:15—18)。顶体帽内外膜之间腔隙狭窄,但顶体帽后端略膨大,与核肩相接(图版Ⅰ:8)。核内染色质开始浓缩,由原来淡染的细小颗粒逐渐融合成粗大致密的颗粒状(图版Ⅱ:10—12),颗粒之间的间隙清亮明显,但颗粒与颗粒之间有细丝相连,形似结晶状(图版Ⅱ:10)。由于染色质浓缩,细胞核体积变小,核膜与核质之间出现间隙,双层核膜也变得松弛弯曲(图版Ⅱ:11),但未见核膜消失和再生现象,此时核大小约为3.2μm×1.1μm。核周围出现微管组装,这些微管围绕细胞核,形成环形核套结构(图版Ⅰ:8, 图版Ⅱ:11,13)。在细胞核的纵切面上,环形核套微管被横切而呈细小泡状(图版Ⅰ:8);相反,在细胞核的横切面上,环形核套微管则被纵切而呈细管状(图版Ⅱ:11)。高倍电镜下,核套微管之间有短桥相连。 第Ⅲ期细胞核变得前尖后宽,核后端凹陷形成植入窝,中心粒移入此处(图版Ⅱ: 12),将参与颈部的结构发育。细胞核更加浓缩,染色质颗粒间隙变小。在顶体