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蜂蜜中芽孢杆菌的分离鉴定及其抑菌活性 蜂蜜是蜜蜂通过仔细的耕作、繁殖和储存在蜂窝中的甜味物质。这是一种高度结合的、透明或透明液体。蜂蜜不仅具有很高的营养价值,而且还具有多种生物学活性,如抗氧化、解毒、抗菌、消炎、滋润、防腐、保护创面、促进细胞再生等。 由于蜂蜜具有渗透势低、水分质量分数低(17%~22%)、p H值低(3.2~4.5)、葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化不断产生过氧化氢、粘度高、含有抗氧化剂和抗菌物质等特点,故蜂蜜中所含营养生长阶段的细菌极少。微生物大部分以孢子的形式存在,使得蜂蜜能保存很长时间。有研究发现,蜂蜜对60多种细菌以及7种真菌有抑菌作用,其中对炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、白喉状杆菌、大肠杆菌、肺炎杆菌等均有明显的杀菌作用。 大多数芽孢杆菌对蜂蜜的品质和人类健康影响较小,但肉毒杆菌危害较大。据报道,在蜂蜜中发现了肉毒梭状芽孢杆菌的孢子,其能够引发婴儿肉毒杆菌中毒。但也有研究从蜂蜜中筛选得到一些细菌,并发现其能产生一些抑菌物质进而抑制一些病原菌的生长。 作者从4种蜂蜜中筛选得到了8株细菌,通过生理生化实验及形态学观察,结合16S r RNA基因序列分析对这些菌种进行了鉴定,然后初步研究了8株菌对大肠杆菌,痢疾杆菌及粘质沙雷氏菌的抑菌作用。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 广西与广西的蜜、树和枣花蜜 研究采用的4种蜂蜜为未经过加工的蜂蜜,分别为小茴香蜜(产于广西),桉树蜜(产于广西扶缓),五倍子蜜(产于广西南丹)和枣花蜜(产于河南)。使用前避光室温放置。 1.1.2 菌株和培养基 大肠杆菌(Escherichia coli),痢疾杆菌(Shigella dysenteriae S7Na Cl),粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens SYBCT02)均保存于作者所在实验室。 1.1.3 不同葡萄糖的量分数 1)营养琼脂培养基(组分g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,Na Cl 5.0,琼脂20.0;p H 7.2~7.4。 2)验证培养基:含葡萄糖的营养琼脂培养基,分别含质量分数20%、30%、40%、50%的葡萄糖。 3)TSA培养基(组分g/L):胰蛋白胨17.0,大豆胨3.0,葡萄糖2.5,Na Cl 5.0,K2HPO4·3H2O 2.5,琼脂15.0(或7.5);p H 7.1~7.5。 4)种子培养基(组分g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,Na Cl 5.0,p H 7.2~7.4。 5)发酵培养基(组分g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,K2HPO4·3H2O 1.5,Mg SO4·7H2O 2.5;p H 7.0。 生理盐水:Na Cl 0.85 g/d L。 1.2 实验方法 1.2.1 培养营养培养基 4种蜂蜜用灭过菌的生理盐水稀释到质量分数为75%,分别取200μL涂布在营养琼脂培养基上,放置在培养箱于30℃培养。每天观察,每长出一个菌落都要转接到新鲜的培养基上,划线分离纯化直到长出单菌落,转接并保藏菌种。 1.2.2 菌落的生长测定 用含糖培养基验证分离得到的菌,先在含糖20 g/d L的营养琼脂培养基上转接筛到的菌落,30℃培养一段时间观察菌落是否能够生长。把能够在含20 g/d L的葡萄糖培养基上生长的菌落再转接到含糖30 g/d L的培养基上,观察是否生长。依次再转接到含糖40、50 g/d L的培养基上,筛选出耐高糖的菌落,转接保藏菌种。 1.2.3 生理生化实验 1)菌体形态观察和生理生化实验:把筛到的细菌转接到倒有营养琼脂培养基的平板上,30℃培养24 h,观察菌落形态特征;根据《伯杰细菌手册》和《常见细菌鉴定手册》中的方法测定其生理生化特性。生理生化实验包括淀粉水解、V-P试验、M-R试验、过氧化氢酶的产生、反硝化、明胶液化试验、柠檬酸盐的利用、脲酶的测定以及糖发酵试验等。 2)系统进化树的构建:将筛到的细菌送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序结果通过与NCBI上已有序列进行Blast同源检索,通过Bio Edit软件进行转换,并用MEGA 4.0.2软件采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建,重复取样1 000次进行自展值(bootstrap value)分析,以评估系统发育树的置信度,确定菌种在进化中的位置。 1.2.4 菌落培养 用接种针将分离得到的细菌分别点种到倒有TSA(1.5 g/d L的琼脂)的平板上,30℃培养48 h,直到有菌落长出。然后把融化的TSA(0.75 g/d L的琼脂)培养基冷却到40℃左右(以不烫手为准),取2 m L加入200μL指示菌,混匀,分别涂布在已长有菌落的平板上,30℃培养24 h,观察是否有抑菌圈。 1.2.5 发酵液培养与除菌 将