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固氮菌藻酸盐的制备及对山羊生产性能的影响 棕色杆菌（azotobac细胞）是一种自生固氮菌。对生物固氮的研究 (特别是固氮酶生物学) 多使用此细菌。棕色固氮菌在代谢过程中产生藻聚糖, 藻聚糖属低聚糖, 低聚糖作为双歧杆菌生长促进因子, 是20世纪70年代由日本东京大学光罔教授发现。以木聚糖为代表的低聚糖目前已广泛用于动物饲料添加剂。显而易见, 开发应用棕色固氮菌藻酸盐可提供新的动物饲料添加剂来源。为促进贵州草地畜牧业生产, 分别在贵州龙里、天柱、麻江、丹寨、毕节等县 (市) 实施种草养羊项目, 对贵州固氮菌进行了资源调查、分离培养、生化鉴定、生产工艺研究, 通过棕色固氮菌藻酸盐的制备, 配制了山羊藻酸盐饲料及其对山羊生长性能影响的初步试验, 以期为缩小山羊养殖周期、增强抗病能力和减少山羊对山坡、山林的过度依赖提供技术参考。 1 材料和方法 1.1 紫染液的制备 1) 甘露醇, 蔗糖, 磷酸二氢钾, 硫酸镁, 氯化钠, 碳酸钙, 钼酸钠, 硼酸, 硫酸锰, 硫酸亚铁, 双蒸水。 2) 无菌研钵, 无菌玻璃棒, 接种环, 天平, 存放有载玻片的酒精缸, 盖玻片, 香柏油 (或其他镜油) , 酒精灯, 火柴, 镊子, p H值试纸, 吸水纸, 玻璃铅笔, 培养皿, 结晶紫染液。欧林巴氏显微镜系列, 超纯水器, 卧式高压消毒柜, 台式高速冷冻离心机, 电子分析天平, 酸度计, 控温、控湿全自动生化培养箱, 轨道式振动摇床, 超生波裂解仪, 超静工作台以及中试品净化车间。 1.2 不低于2.5%.2%的情形 采集肥沃土壤土样 (土壤溶液的p H值不低于6.5) 。取10 mg土壤, 放在无菌研钵中, 注入5 m L无菌水, 并用无菌玻璃棒搅拌均匀, 备用。 1.3 藻酸盐饲料对黑山羊生长性能的影响 1) 30日龄家兔20只, 分成2组进行藻酸盐饲料安全试验和生长性能测定试验, 试验期40 d。 2) 60日龄本地黑山羊30只分成3组, 开展藻酸盐饲料对山羊生长性能的影响试验;其他30~50日龄黑山羊、简阳大耳羊、麻羊和波杂山羊共28只按常规放牧补饲。 1.4 添加ph值 甘露醇10 g或蔗糖15 g、磷酸二氢钾0.8 g、硫酸镁0.2 g、氯化钠0.2 g、碳酸钙1 g、钼酸钠0.05 g、硫酸亚铁0.1 g、琼脂15 g, 水1 000 m L, 调p H值为6.5~7.2, 121℃高压灭菌备用。 1.5 粗制色固氮菌藻酸盐 方法一 (改良异丙醇抽提法) :按常规方法对棕色固氮菌进行分离培养与保存。按1∶20取棕色固氮菌菌液, 在无氮液体培养基上培养2~3 d, 然后将培养物均匀涂布到平板培养基中培养2~3 d, 刮取所有培养物, 用生理盐水洗涤、离心, 弃去上清液, 沉淀用4℃异丙醇抽提, 抽提剩余物用生理盐水洗涤, 冷冻干燥, 即得粗制棕色固氮菌藻酸盐。 方法二 (改良水煮沉淀法) :在20 m L无氮液体培养基中加1μL棕色固氮菌培养液, 26~30℃摇床培养2~3 d, 然后将1.5 m L培养物均匀涂布移植到平板培养基中, 恒温箱26~30℃培养2~3 d, 20 m L菌液可以涂布13个中号培养皿。分别加水2 000 m L, 80℃水浴8 h, 离心10 min, 所得上清液浓缩至1/4体积, 浓缩液加入3倍量95%乙醇, 过夜, 弃上清, 3 000 r/min离心10 min, 所得沉淀真空干燥, 干燥物即为棕色固氮菌藻酸盐。 1.6 藻酸盐添加剂 筛选一种棕色固氮菌藻酸盐饲料, 由玉米面50份、麸皮23份、黄豆粉10份、油枯7份、骨粉1.5份、磷酸钙0.5份、食盐0.5份和藻酸盐饲料添加剂 (添加剂由辅料和添加剂组成, 其中含1.5%藻酸盐) 混合而成。 1.7 饲料的投放 试验开始前1周给20只小白兔喂饲料, 自由采食, 1日3次, 每组每次200 g, 饮水器自由饮水。2周后, 试验组投放含0.15%藻酸盐的饲料。每周称重1次;对照组按常规投料。分早中晚3次喂料, 另取0.4~1.0 kg饲料拌入优质青草1.0~2.0 kg饲喂。每天早晚观察家兔行为体征, 并记录。40 d后进行屠宰试验。 1.8 试验1:高造运动饲料 试验动物:选择60日龄本地黑山羊30只, 分成3组进行生长性能测定试验。试验期75 d。 试验开始前一周喂饲料, 自由采食, 每组每只300 g, 1日2次, 自由饮水。2周后, 试验Ⅰ组每千克饲料加入含0.15%藻酸盐的饲料添加剂, 试验Ⅱ组加入含0.15%红糖的饲料, 对照组按常规饲喂配合饲料。试验期每只采食量由400 g饲料逐步增加到1 200 g, 并按0.2~0.6 kg饲料拌优质青草0.4~2.0 kg饲喂。每两周称重1次。早中晚2次喂料, 每天早晚观察山羊行为体征, 并记录。7