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一点红hplc指纹图谱及含量测定研究 点红色系（l.）是科可科氏科的一种红色系植物，也被称为背叶红、叶下红和羊蹄草。分布在云南、贵州、广西、湖南、山西等地。该植物全草入药,味苦性凉,具有清热解毒、散瘀消肿的功效。现代药理学研究表明,一点红具有细胞毒、抗菌抗炎、抗氧化、镇痛等活性。一点红中含有黄酮、生物碱、甾体及其他类型的化学成分。目前,一点红药材的质量多以黄酮或生物碱的含量作为评价依据。然而中药的疗效可能是多成分协同作用的结果,单一或几个成分含量难以全面反映药材内在质量。中药指纹图谱因其具有整体性、模糊性和可以量化等特点,能够较全面地反映中药的整体质量,已成为国际上公认的控制中药质量的有效手段。本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)建立广西9个地区10批一点红药材的HPLC指纹图谱,并计算相似度。此外,同时测定了10批一点红药材中3个咖啡酰奎宁酸类成分新绿原酸①、绿原酸②、隐绿原酸③的含量,为一点红药材的质量控制提供参考。 材料表面 1. 供试材料及试剂 乙腈、甲醇(色谱纯,Honeywell公司),水(娃哈哈公司),甲酸(色谱纯,天津光复精细化工研究所),其他试剂均为分析纯。 一点红药材(见表1)均由广西壮族自治区花红药业股份有限公司提供,经中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为菊科一点红属植物一点红Emilia sonchifolia(L.)DC的全草,各标本存于中国医学科学院药用植物研究所。对照品新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供(批号分别为X-014-130126,L-007-121018,Y-067-120825),经检测纯度均98.0%。 流动相-0.1%苯甲酸水法 色谱柱:Phenomenex C18色谱柱(250mm×4.6mm,4μm);流动相:0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相,梯度洗脱(0-7min,5%→8%A;7-17min,8%→15%A;17-45min,15%→30%A;45-55min,30%→50%A;55-60min,50%→100%A),流速1.0m L/min,检测波长326nm,柱温为30℃;进样量10μL。 2. 续滤液的制备 精密称取一点红药材粉末(过40目筛)1.000g置于250m L烧瓶中加50m L50%甲醇,水浴加热回流提取2h,滤过,回收溶剂,得残渣,用50%甲醇溶解残渣并定容至10m L容量瓶中,摇匀,静置,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,待用。 3. 方法研究 3.1 仪器精密度实验 取供试品溶液(样品3),连续进样6次,分别对共有峰的保留时间和峰面积进行考察,结果表明,各共有峰保留时间的RSD1.0%,峰面积的RSD3.0%,表明仪器精密度良好。 3.2 溶液稳定性试验 取供试品溶液(样品3),分别在0、2、4、8、12和24h进行分析,考察共有峰的保留时间和峰面积,结果表明,各共有峰保留时间的RSD1.0%,峰面积的RSD3.0%,表明供试品溶液在24h内稳定性良好。 3.3 检测方法试验 取同一批号的供试品(样品3)6份,按照供试品溶液的制备与检测方法进行试验,分别对共有峰的保留时间和峰面积进行考察,表明各共有峰保留时间的RSD1.0%,峰面积的RSD3.0%,表明重复性良好。 4. 指纹图谱的生成 按“2.”项下供试品制备方法处理,“1.”项下色谱条件,分别记录10批一点红药材的HPLC图谱。将所得图谱导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价软件A”(2004版),以样品1为参照图谱,经多点校正,数据匹配,以中位数法生成对照指纹图谱R,见图1,确定了18个共有特征峰,可作为判别一点红药材质量的群体特征峰,其中峰1、3、4分别为对照品①、②、③的峰。18个共有峰保留时间RSD1.0%,说明各产地药材共有峰保留时间一致。10批不同产地一点红的HPLC指纹图谱共有模式样品指纹图谱见图2,10批样品的指纹图谱与对照图谱R相比,其相似度范围在0.851-0.992之间(见表2)。 5. 重量测定 5.1 含量测定的色度条件 5.2 备溶液0.“m” 分别精密称取上述3个咖啡酰奎宁酸类对照品适量,加50%甲醇分别制成对照品的储备溶液(①0.884mg/m L;②1.744mg/m L;③1.014mg/m L)。分别精密吸取各对照品储备液各2.00m L,制成每1m L含化合物①、②、③分别为176.80、348.80和202.80μg的混合对照品储备液。 5.3 测定试验溶液的制备 5.4 含量测定的成本研究 5.4.1 线性关系的测定 分别精密吸取混合对照品溶液0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20m L