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基于血液微透析技术的青藤碱药动学研究 微透析技术是用于测定组织细胞外液中游离药物浓度的连续、实时和实质性采样技术。血液微透析(blood microdialysis)的具体方法是将一根静脉血管探针(iv vascular probe,属同心圆型探针)植入到动物的静脉血管中(一般是颈静脉),并利用人工细胞外液Krebs-Ringer溶液对探针进行灌流,测定流出端透析液中待测药物的含量,再通过探针的回收率计算血液中的药物浓度。 青藤碱是中药青风藤中的主要有效成分,具有抗炎、免疫抑制、抗心率失常等作用。体外研究表明,青藤碱适于采用微透析法进行取样。本文采用血液微透析技术进行青藤碱的药动学研究,现报告如下。 1 材料和仪器 1.1微透析系统采用美国BAS公司生产的微透析设备。探针为用于血液微透析的同心圆型探针(IV-5 vascular microdialysis probes,MD2305),透析膜长度为5 mm。微透析系统的其他主要部分包括:灌注器推进泵(baby bee syringe drive,MD1001)、灌注器(1 mL bee stinger gastight syringer,MD-0100)、灌注器支架(3-syringe bracket for baby bee,MD1002)、流速控制器(work bee controller,MD1000)。灌流液为人工细胞外液——Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液(NaCl 122 mmol/L、KCl 3 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、KH2PO40.4 mmol/L、NaHCO325mmol/L、CaCl21.2 mmol/L),Krebs-Ringer溶液临用前配制,青藤碱在每次实验前新加入。 1.2分析系统高效液相色谱仪(HPLC)为德国DIONEX公司的产品,包括P680液相泵、TCC100柱恒温箱和UVD 170U可变波长紫外检测器;分析柱为大连依利特分析仪器有限公司的产品,填料为Hypersil ODS2 5μm,尺寸为4.6 mm×250 mm。 1.4药物和试剂青藤碱购于宝鸡市荣德生物工程有限责任公司,经用结晶法提纯后青藤碱的纯度为92.24%;HPLC级甲醇由美国DIMA TECHNOLO-GY INC.生产,购于广州市东征化玻仪器有限公司;正清风痛宁注射剂,湖南正清药业有限公司生产(批号:0502103)。 1.5动物SD大鼠10只,雄性,300～320 g,由广东省医学实验动物中心提供(合格证号:2064A021)。 1.5其他1次性使用静脉留置针(Y型):由苏州碧迪医疗器械有限公司出品;软质橡胶管(外径3 mm)及硬质橡胶管(外径2.5 mm)。 2 回收率的确定 2.1样品分析方法样品中青藤碱浓度采用高效液相色谱法测定。流动相为V甲醇:V水:V乙二胺=50:50:0.25,流速为1 mL/min,检测波长为265 nm。采用手动进样,进样量为10μL。在该条件下,青藤碱的峰形好,不拖尾,出峰时间约为8.5 min。该系统的最低检测限量能够满足本研究中可能达到的最低浓度。通过绘制的标准曲线发现,在本研究中所需的青藤碱浓度范围内(0.136 4μg～8.184μg),吸收峰面积积分值与青藤碱的浓度呈线性,回归方程为Y=15.928X,r=0.999 8。 2.2“旁路循环胶管”的制作在进行大鼠手术操作之前,先制备1条带分支的“旁路循环胶管”(图1)。其作用是在大鼠的颈动脉与颈静脉之间建立1个位于体外的旁路循环,以方便血液探针的插入。具体方法为:取1支临床上1次性使用的静脉留置针(.Y型),只留下其Y型接头部分,其他部分剪掉,分别接上动脉端胶管、静脉端胶管及微透析探针即可。注意接口部分(尤其是探针的插入口)不能发生漏液;探针的插入部分要尽量深入,保证有效透析膜部分全部浸入在血流中。 2.3大鼠的手术操作将大鼠用戊巴比妥麻醉,固定,躺卧于操作台,去毛后在颈部正中位置切口,分离出颈静脉,结扎远心端;在颈静脉注入肝素生理盐水,防止实验过程中凝血;找到另一侧的颈动脉,结扎远心端。在颈静脉上剪一“V”形小口,将“旁路循环胶管”的静脉端从近心端小心插入颈静脉中,确保血流通畅后扎紧。用止血钳将颈动脉夹紧(尽量靠近近心端),将“旁路循环胶管”的动脉端插入颈动脉后扎紧。松开颈动脉上的止血钳,可见血流开始从“旁路循环胶管”的动脉端流向静脉端。 2.4给药、取样和样品分析将微透析探针插入“旁路循环胶管”的探针插入口,用Krebs-Ringer溶液以1μL/min的流速先对微透析探针灌流约15 min以待其稳定。用注射器吸取预先制备好的盐酸青藤碱注射液2 mL,通过大鼠尾静脉注入,同时开始收集探针流出端的透析液样品;透析液样品的收集时间间隔为15 min