补阳还五汤、六味地黄丸及合方对脑缺血大鼠学习记忆及海马学习记忆及海马生长相关蛋白、生长相关蛋白和突触素表达的影响.docxVIP

补阳还五汤、六味地黄丸及合方对脑缺血大鼠学习记忆及海马学习记忆及海马生长相关蛋白、生长相关蛋白和突触素表达的影响 认知障碍是脑损伤最持续时间和最重要的结果。这是脑缺勤紧急移动到血管支配性迷宫的过程。正确有效的治疗可以缓解脑瘫进程。益气活血法和补肾法是中医治疗脑血管疾病的常用治法。临床研究表明肾虚气弱血瘀是缺血后认知功能障碍的主要病机。本实验以益气活血法代表方补阳还五汤和补肾法代表方六味地黄丸为研究对象,研究益气活血法和补肾法对脑缺血后认知功能康复的作用及联合效应。并通过观察海马突触素(SYN)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、轴突淀粉样前体蛋白(APP)表达的变化,探讨其作用机制,旨在为血管性痴呆的防治提供新的治疗策略。 1 材料表面 1.1 驱动scxk京 SPF级雄性SD大鼠,体质重280~300 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号SCXK(京)2006-0009。饲养在首都医科大学实验动物中心,许可证号SYXK(京)2005-0022。每3只动物生活在一个饲养笼,自由进食进水,12 h光照/黑暗周期,环境温度(22±1)℃。动物在实验室适应1周后正式进行实验。 1.2 味地黄丸、山药、山茗酯、药 根据2005年《中国药典》补阳还五汤药物组成:黄芪60 g,赤芍9 g,川芎6 g,当归9 g,地龙9 g,桃仁9 g,红花9 g。六味地黄丸药物组成:熟地黄24 g,山药12 g,山萸肉12 g,泽泻10 g,丹皮10 g,茯苓10 g。药材购自北京同仁堂药店,经首都医科大学中药资源老师鉴定,符合GAP标准。由本实验室按常规方法制备。,加水煎煮2次,每次1 h,合并煎液,浓缩成含生药1 g·m L-1的汤剂。 1.3 生物科技有限公司 Tis-组织蛋白抽提试剂、BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;兔抗鼠SYN单克隆抗体、兔抗鼠APP单克隆抗体、兔抗鼠GAP-43单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、羊抗兔Ig G均购自Epitomics公司。 1.4 多元糖酸酶模型检测 Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所研制),Labofuge 400R低温离心机(德国Heraeus),Multiskan MK3型酶标仪(芬兰Thermo Bio Analysis Company产品)。DZF-6020型真空干燥箱,生物显微镜(Nikon Eclipse 80i,日本),图像采集分析系统(NIS-Elements Basic Research,日本)。 2 方法 2.1 cca+eca 参照文献制作大脑中动脉永久性缺血模型。大鼠麻醉后,分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA),同侧颈总动脉永久结扎,于ECA与ICA分叉处作一切口,将制备好的线栓沿CCA顺行插入,插入深度为距动脉分叉17~18 mm,实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。动物入选的标准:动物麻醉清醒后出现对侧前肢倦曲或行走转圈体征则纳入,动物无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。 2.2 补阳还五汤、六味地黄丸、模型组的ig SPF级雄性SD大鼠,体质量280~300 g,采用随机数字表法将大鼠随机分为5组,假手术组10只,模型组15只,补阳还五汤组15只,六味地黄丸组15只,合方组15只。造模后48 h开始ig给药,每天1次,补阳还五汤组13 g·kg-1,六味地黄丸组9.1 g·kg-1,合方组22.1 g·kg-1,模型组和假手术组ig等剂量的生理盐水。每组动物连续给药30 d后进行行为学检测。进入结果分析44只。 2.3 行为记录及训练过程 Morris水迷宫检测学习记忆。Morris水迷宫内壁涂成黑色,水深30 cm,水温(19±1)℃。平台直径8 cm隐藏于水面下1 cm处,利用行为记录系统软件追踪白色大鼠在黑色背景下水迷宫中的运动轨迹、潜伏期、游泳速度及路径长度。整个实验过程分为定位航行实验和空间搜索实验两部分。定位航行实验:大鼠每天训练2轮,每轮2次,分别从平台相邻和相对象限放置大鼠,记录大鼠在60 s内成功进驻平台(大鼠找到平台并滞留其上5 s为成功进驻)所需时间(即逃避潜伏期)。空间探索实验:定位航行实验结束后,撤除平台,大鼠于平台对侧象限入水,观察其30 s内穿越平台所在位置的次数(穿环数)。 2.4 蛋白印迹和酶杂 每组随机取5只动物,Western blot检测。大鼠断头处死,迅速在冰盒中分离海马组织,放置液氮;Tis-蛋白抽提试剂抽提海马组织蛋白,BCA法蛋白定量;10%的SDS凝胶电泳,上样量为10μg,电泳结束后,进行蛋白质转膜;与GAP-43一抗(1∶10 000),SYN一抗(1∶30 000),APP(1∶10 000)杂交反应;再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G