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基于多态性检测的胎儿游离dna检测平台的筛选 使用母血浆中的游离胎儿dna，在产前诊断出单个胎儿遗传因素，是当前产前诊断领域的研究热点。但是, 胎儿游离DNA存在于一个大的母体背景DNA中, 在妊娠母体外周血中含量非常少, 是目前产前诊断领域研究所面临的一个瓶颈问题。为解决这一瓶颈问题, 2008年Li等首次报道了低变性温度共扩增PCR (co-amplication at lower denaturation temperature PCR, COLD-PCR) 技术, 其可以在大量野生型基因背景中优先扩增少量突变基因, 为利用母血浆胎儿游离DNA进行无创性产前诊断单基因遗传病提供了新的技术;2012年Castellanos-Rizaldos等在COLD-PCR技术基础上进行了改进, 首次报道了耐受温度-低变性温度共扩增PCR (temperature-tolerant co-amplication at lower denaturation temperature PCR, TT-COLD-PCR) 技术, 降低了COLD-PCR的实验难度, 使COLD-PCR技术更有利于用于临床。该技术共包括2种形式:快速耐受温度-低变性温度共扩增PCR (temperature-tolerant fast COLD-PCR, TT-FAST-COLD-PCR) 技术及完全耐受温度-低变性温度共扩增PCR (temperature-tolerant full COLD-PCR, TT-FULL-COLD-PCR) 技术, 目前该技术仅被用于富集外周血中肿瘤来源的游离DNA突变, 在无创性产前诊断方面的应用尚无报道。 本研究以广东地区最常见的单基因遗传病β地中海贫血IVS-II-654型及CD41-42型作为切入点进行研究, 通过检测母血浆中胎儿游离DNA突变, 拟建立一种简便、高效的可富集母血浆中胎儿游离DNA突变的实验平台, 评价其在母血浆中富集、鉴定胎儿游离DNA突变的适用范围。 材料和方法 1 材料表面 1.1 周日染子基因检测 第一阶段选取2012年3月~2012年9月就诊于中山大学附属第三医院产科门诊及产科实验室的20例β地中海贫血 (其中IVS-II-654型9例及CD41-42型11例) 患者外周血标本;第二阶段选取2012年3月~2013年2月就诊于中山大学附属第三医院产科实验室的4对均为β地中海贫血的夫妇外周血标本, 见表1;所有外周血标本均使用血常规管 (EDTA抗凝) , 抽取数量为8 m L;夫妇双方β地中海贫血基因类型均于我院产科实验室通过基因测序技术确诊。本研究严格按照中国医学伦理委员会的要求, 已征得所有研究对象的知情同意, 并均已签署知情同意书。 1.2 整体样本检测 对上述4例孕妇, 于抽血前实施羊膜腔穿刺术抽取羊水细胞标本, 所有羊水细胞标本基因类型均通过基因测序技术确诊, 胎儿基因型以此检测结果作为金标准进行对照。 2 方法 2.1 dna的提取 取EDTA抗凝的外周血2 m L, 混匀后取200μL用于提取DNA。采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) , 按照说明书操作提取DNA。使用p H为8.0的TE缓冲液将DNA稀释至终浓度为100 mg/L。 2.2 hbc基因内杂合度分析 使用Haploview软件, 对HBB基因进行SNP与单倍型分析, 检索HBB基因内杂合度较高的SNP位点;检测收集样本中与IVS-II-654位点及CD-41-42位点连锁的SNP位点。 2.3 pcr-pcr检测 引物序列信息见表2。本研究所选试剂均由Invitrogen公司提供, 总反应体系为25μL:2.5μL 10×PCR Buffer (不含Mg2+) ;0.75μL Mg Cl2;1.0μL PCR引物 (0.4μmol/L) ;1.5μL DNA模板;18.55μL dd H2O;0.2μL Platimum Tap DNA Polymerase。 2.4 变性30s,变性20s; 孕妇外周血分别利用TT-FAST-COLD-PCR及TT-FULL-COLD-PCR技术, 其反应循环条件分别如下: (1) 95℃预变性5 min;95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s;循环25次;75.7℃变性30s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s;76.0℃变性30 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s;76.3℃变性30 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s;76.6℃变性30 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s;76.9℃变性30 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s;70℃延伸7 min;产物于4℃条件下保存