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食源性微生物感染的危害及防控 无论是在发达国家还是在发展中国家，食品起源疾病都是影响公众健康的重要因素。其中,由微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的首要因素。在人的食物链中,沙门氏菌、空肠弯曲菌、单增李斯特菌都是重要的食源性致病菌。如美国2011年下半年爆发了一起单增李斯特菌引起的食源性疾病暴发事件,从2011年7月31日出现首例报告病例至10月6日共报告病例109例,这是10多年来美国最严重的一起食源性疾病暴发事件,此次暴发涉及到美国24个州。我国同样面临着这种现状,这严重影响到了食品工业的发展和消费者对食品行业的信心。开发食品中微生物的快速检测技术,已成为业内的共识。 对于微生物检测,在准确的前提下,与传统检测方法相比,可以大幅度缩短检测时间,即可视为快速检测方法。快速检测虽然不能作为最后的确证方法,但是实际情况监管分散、样本分散以及样本量不均,使用快速检测方法对样本进行初步筛选后再将可疑样本进行仪器确证,可以大大提高检测效率。由于食品快速检测技术具有检测快速、省力等优点,受到了食品企业和监管检测部门的欢迎。本文就国内外食品致病微生物快速捡测方法及研究现状进行综述。 1 elisa测定 免疫学分析方法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,也是食品检验技术中的一个重要组成部分。其中酶联免疫吸附测定法的应用较为普遍。 酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是在酶联免疫技术的基础上发展起来的免疫测定技术。它的工作原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面,加入酶标抗体或抗原,使抗原抗体反应在固相载体表面进行,形成酶标记的免疫复合物,经洗涤后,游离的酶标抗体或抗原被冲洗掉,酶标记的免疫复合物不会被冲洗掉,加入酶的底物显色后,便可进行定性或定量测定。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。由于ELISA的技术条件要求低,携带方便,常以试剂盒的形式出现且易商品化,它已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。 伤寒沙门氏菌是影响人们健康的一种致病菌。Jain等采用以下步骤处理黑色的聚碳酸酯膜,先依次在浓硝酸和水中清洗,后浸没在30%的氢硼化钠溶液中2 h,再用1X-PBS洗去氢硼化钠。最终制成修饰后的聚碳酸酯膜(m PC),再将伤寒沙门氏菌抗体吸附在薄膜上,将此作为ELISA的载体。同传统的用聚苯乙烯作为ELISA载体的方法相比,改进后的免疫实验可以灵敏地测出伤寒沙门氏菌,检测限可以达到103cells/m L,远远低于伤寒沙门氏菌的感染剂量(105cells/m L),并且不需要样品预富集时间,能够在4.5 h之内完成。 2 复合pcr检测致病性微生物 聚合酶链反应(Polymeras Chain Reaction)简称为PCR技术,PCR反应极其迅速,可在短短几小时内,将极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段扩增上百万倍。目前,该技术已成功应用于食品中多种致病菌的检测当中。 王文娟等选用目标菌高度保守的序列,根据大肠杆菌O157:H7的溶血索hly AB基因、志贺氏菌的侵袭质粒抗原H基因ipa H和致病性蜡样芽孢杆菌的溶血素hbl A基因设计PCR引物,特异地扩增出目的基因,从而实现对3种致病微生物的快速检测。根据此原理研制的快速检测试剂盒可在5 h内(包括样品前处理时间)检出食品或其原料中的大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌,具有特异、快速、灵敏的特点。 美国密苏里大学在对实时PCR技术改进的基础上发明了一种灵敏度更高的更为迅速的沙门氏菌检测方法,仅5~12 h就可完成测试。研究人员用单叠氮溴化乙锭染料结合PCR技术对试样进行了处理,单叠氮溴化乙锭进入死的沙门氏菌体内后与DNA分子进行结合,使得沙门氏菌细胞在染色后不能被溶解,同时染料不能穿透活细胞,这使得改进后的PCR技术容易区分活的和死的细胞,避免假阳性结果的出现。 3 寡核苷酸探针行为的筛选 核酸探针是指带有检测标记的已知核苷酸片段,能与互补核苷酸序列退火杂交,并可以被特殊的方法所探知。该项技术不仅具有特异性、灵敏度高的特点,而且兼备组织化学染色的可见性和定位性,从而特异地显示细胞的DNA或者RNA。 Hong等将尼龙薄膜用作支撑阵列。从14种引起食源性疾病的细菌和两种不相关的细菌提取含23S r RNA的突变区域,并将其选作辨别的目标。用一对通用的底料为23 Sr RNA基因的PCR扩增做准备,21种特异性探针被合成并且被安到尼龙薄膜上,再向14种病原菌的23 Sr RNA扩增产物杂交入寡核苷酸探针阵列,杂交结果用地高辛酶联显色反应分析。结果显示,九种食源性病原菌(大肠杆菌,空肠弯曲菌,痢疾