固相萃取-反相高效液相色谱法测定畜牧粪便中磺胺类、四环素类和喹诺酮类.docxVIP

固相萃取-反相高效液相色谱法测定畜牧粪便中磺胺类、四环素类和喹诺酮类 1 畜禽粪便中抗生素的检测方法 因为抗生素可以促进动物的生长，防止疾病的治疗和预防，并且长期被广泛使用。副作用非常严重。大多数抗生素以还原化合物的形式从粪便和尿液排出环境。有研究表明,粪便中土霉素浓度高达29 mg/kg,金霉素26 mg/kg,磺胺二甲嘧啶100 mg/L。以前对畜牧业中抗生素的研究主要集中于畜禽生物体残留上,进入环境中的抗生素具有诱导基因突变的潜在可能。畜牧粪便作为抗生素进入环境的一个重要来源,是必须引起各方面关注的一个重要问题。 抗生素测定的方法有分子印迹,亲和免疫等方法,比较而言,液相色谱法能更好地同时分析多种抗生素。此外,粪便样品前处理方法也需要提出高效方法,为制定粪便中抗生素的测定标准奠定基础。 本研究通过比较硅胶键合碳18(spe-pak C18)萃取小柱、亲水亲脂萃取小柱(HLB)和国内C18固相萃取小柱的萃取效率,以及不同材质的微孔滤膜(醋酸纤维,玻璃纤维,聚四氟乙烯和尼龙),不同的样品浓缩方法,色谱分离条件,并结合不同来源粪便的组分不同,探讨畜禽粪便中抗生素前处理的优化方法。优化后的方法成功用于天津市畜牧常用的土霉素、四环素等13种抗生素在畜牧粪便中残留的检测。 2 实验部分 2.1 浓缩仪和固相萃取柱 高效液相色谱仪-紫外检测器(Waters公司);十二孔固相萃取装置(美国Supelco公司);FD-1E冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司);Hettich 32R冷冻离心机(德国Hettich公司);Heidolph 2旋转蒸发仪(德国海道尔夫);MTN-2800W氮气浓缩仪(天津市奥特赛恩斯仪器有限公司),0.7 μm GF/F玻璃纤维滤膜(英国Whatman公司),0.45 μm聚四氟乙烯微孔滤膜(德国Sartorius公司),尼龙膜(美国Phenomenex公司),醋酸纤维微孔滤膜(美国Phenomenex公司)。OASIS HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg, Waters公司);Sep-pak固相萃取柱(6 mL/500mg,Waters公司)。 土霉素(OTC),四环素(TC),金霉素(CTC),强力霉素(DOXY),磺胺嘧啶(SDZ), ,磺胺二甲嘧啶(SDMe),磺胺氯哒嗪(SCP), 磺胺甲唑(SMZ),磺胺二甲氧嘧啶(SDO)均为Fluka公司产品;呋喃唑酮(FUR), 环丙沙星(CIP), 培氟沙星(PEF), 氯霉素(CAP)购于中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈均为色谱纯; Na2HPO4、Na2EDTA、柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯;草酸、醋酸铵为优级纯。 2.2 标准溶液配制 准确称取上述的13种抗生素药物标准品各0.010 g,其中4种四环素(tetracyclines, TCs)、5种磺胺类(sulfonamides, Sas)和CAP加入少量甲醇溶解,然后转移到100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,配制成100 mg/L的标准储备液。FUR 用V(乙腈)∶V(水)=8∶2的混合溶液溶解并定容到100 mL,CIP和 PEF用超纯水溶解并定容到100 mL。以上标准储备液均保存在4 ℃冰箱中。混合标准溶液(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0、50.0、100和200 mg/L)均由储存标样加流动相稀释配制而成。 称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸,分别配制成0.2、0.4和0.2 mol/L的溶液,柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照8∶5(V/V)混合,配制成McIlvaine溶液。取37.2 g Na2EDTA于1 L McIlvaine溶液中,配得0.1 mol/L EDTA-McIlvaine提取液。分别配制0.1 mol/L柠檬酸钠溶液和柠檬酸溶液,按照1.4∶18.6(V/V)混合,配制成柠檬酸缓冲液,用柠檬酸缓冲液调节乙腈pH=4.7。 2.3 粪毒和猪提取物的提取 于2007年10～11月在天津市4个养殖基地采集了9个猪粪样和11个鸡粪样。冷冻干燥粪便样品,分别称取1 g猪鸡粪便,其中猪粪便用10 mL柠檬酸酸化乙腈提取,鸡粪便用EDTA-McIlvaine提取液提取,粪便样品在漩涡混匀器上2500 r/min混匀10 s, 25 ℃超声15 min, 然后在4 ℃,4500 r/min条件下离心15 min,重复提取两次,收集上清液通过聚四氟乙烯过滤膜。猪样品上层清液用10 mL正己烷萃取两次,氮气吹近干,用100 mL超纯水稀释,通过玻璃纤维过滤膜,用固相萃取小柱浓缩。对于鸡粪样上层清液,直接通过固相萃取小柱,用甲醇洗脱固相萃取小柱,氮气吹干后,用1 mL甲醇定容,待测。 2.4 线性结果与标样的检测 测定4种四环素类及