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布南色林药物浓度的测定 布南香林，2-（1-pipamatinyl）-4-（4-fluoropiel）-5、6、7、8、9和10-hexaeconomica（b）-pylimate）是日本迪友制药有限公司开发的一种新型抗癫痫药物，对氨基乙二醇和五羟胺5-ht2a的受体有很强的抑制作用。研究表明,布南色林对于改善精神分裂症的阳性与阴性症状疗效良好,而且没有发现抗精神病药物常见的锥体外系症状不良反应,有望成为治疗精神分裂症的一线药物。为进行布南色林在中国人群中的药动学研究,有必要建立其在生物样本中的浓度检测方法,目前国外已有测定人血浆中布南色林浓度的LC-MS/MS方法,但多采用固相萃取,操作繁琐,试验成本高,对于人尿液中布南色林及其代谢物的测定方法,国内外均未见报道。本试验拟采用液-液萃取法建立一种简单快速的测定人尿液中布南色林与其活性代谢物N-去乙基布南色林(布南色林C)的LC-MS/MS法,并将其应用于布南色林I期临床试验的药动学研究。 1 仪器和试剂 布南色林对照品(质量分数100%,批号、内标物布南色林B(质量分数100%,批号、布南色林代谢物N-去乙基布南色林[2-(1-piperazinyl)-4-(4-fluorophenyl)-5,6,7,8,9,10-hexahydrocycloocta[b]-pyridine)]对照品(布南色林C,质量分数100%,批号、内标物布南色林D(质量分数100%,批号均由丽珠集团丽珠医药研究所提供;乙腈(色谱纯,默克公司);甲酸铵(质谱纯,美国Sigma公司);甲酸、乙酸乙酯和二氯甲烷(色谱级,迪马公司);NaHCO3(分析纯,广州化学试剂厂);水为重蒸去离子水。 Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent),包括G1379B自动脱气机,G1310A自动调配四元泵,G1329A自动进样器,G1316A可调柱温箱;Agilent 6410三重四级杆串联质谱仪;XW-80A 型旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂);BP110S 型电子分析天平(德国Sartorius公司);MIKRO12-24型高速离心机(德国Hettich公司);111 型真空干燥箱(德国MMM-Group公司)。 2 方法和结果 2.1 甲酸甲酰胺甲醛 色谱柱:Agilent Eclipse plus C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm);流动相为乙腈-水(体积比87∶13,含0.00 5 mol·L-1甲酸铵和质量分数0.1%甲酸);流速为0.5 mL·min-1;柱温为40 ℃;进样量为4 μL。 质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子化,毛细管电压4 000 V,喷雾气压力344.75 kPa,干燥气体流速10 L·min-1,干燥气体温度350 ℃。扫描方式为选择性离子监测(SRM),布南色林、布南色林B、布南色林C与布南色林D的裂解方式及碰撞能量分别为m/z368.2→297.2、396.3→297.2、3 40.2→297.1和356.2→313.3。电子倍增器400 V。布南色林、内标布南色林B、布南色林C和内标布南色林D的分子裂解图见图1。 2.2 提取剂为混合物质的提取剂为2-甲基苯甲酰甲胺2-甲基苯磺酸酯-2-甲基苯磺酸酯2. 取含药尿液0.5 mL置10 mL的具塞磨口锥形玻璃离心管中,加入10 000 ng·L-1的内标流动相溶液50 μL,快速振荡3 s,加饱和NaHCO3溶液0.2 mL,快速振荡15 s,再加乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比4∶1)混合提取剂3 mL密塞,旋涡振荡1 min,3 000 r·min-1离心10 min, 吸取有机层2.8 mL置3 mL的带塞磨口锥形玻璃离心管内,42 ℃真空干燥至干。进样前加入流动相混合溶液200 μL,快速振荡5 s使残渣溶解,3 500 r·min-1离心10 min,吸取上清液4 μL进样。 2.3 空白山灰水相关系数的确定 分别取12名受试者的空白尿液0.5 mL置10 mL的具塞锥形玻璃离心管中,除不加内标外,按“2.2”项依法操作,进样4 μL,获得空白尿液样品的色谱图,如图2A;将一定质量浓度的对照品溶液和内标溶液加入空白尿液中,依同法操作获得相应的色谱图,如图2B,布南色林、布南色林B的出峰时间约为4.2 min和4.7 min,布南色林C、布南色林D的出峰时间约为3.9 min和4.4 min;取健康受试者给药后收集的尿液样品,同法操作,得色谱图2C。结果表明,空白尿液中内源性物质不干扰布南色林、布南色林B、布南色林C及布南色林D的测定。 2.4 建立线性关系 取空白尿液0.5 mL,分别加入质量浓度为0、1