光和4种ga对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响.docxVIP

光和4种ga对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响 植物种类的发芽是一个复杂的过程，受到各种内部和外部因素的影响，其中光和ga是两个重要因素。拟南芥种子是典型的需光发芽种子。尽管照光或赤霉素处理均明显促进萌发早已为人所知,然而两者之间的关系则众说纷纭(Talon 等1990,Zeevaart 1992)。井上(1989)认为光的作用在于促进赤霉素的生物合成,从而诱导萌发,然而Dorkx和Karssen(1993)认为赤霉素也可直接促进拟南芥种子的萌发。本文以拟南芥GA的不敏感型和缺陷型突变体为材料,研究了光和GA在拟南芥种子萌发过程中的相互关系。此外还从比较不同拟南芥突变体幼苗呼吸代谢中主要酶的活性入手进行了探索。 1 材料和方法 1.1 突变体的诱导诱导 拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)野生型Landsberg erecta种子及GA缺陷型突变体ga-1,ga-2,ga-3和对GA不敏感型突变体ga-i的种子(均由拟南芥生物资源中心提供)经表面消毒(70%乙醇3 min ,然后6%次氯酸钠10 min,最后用无菌水洗3次)后播种在含0.8%琼脂的PNS(Estelle和Somerville 1987)培养基上,播种后置于暗处作为暗处理,光照处理的则在35 μmol m-2s-1的光照下采用每天24 h连续光照,均在25℃恒温培养。播种后第5天观察并统计种子的萌发率。 1.2 突变体种子萌发率测定 烯效唑是GA合成途径中贝壳杉烯氧化的抑制剂;prohexadione是GA生物合成途径中依赖2-氧代戊二酸盐的加双氧酶(dioxygenases)的抑制剂。 含有烯效唑(uniconazole)10-5mol/L的PNS固体培养基中,分别加入不同浓度的GA1、GA3、GA4、GA9。把不敏感型突变体ga-i种子播种在上述培养基上,分别在光下和暗中培养,5 d后观察并统计种子的萌发率。prohexadione的处理浓度为10-4mol/L。 1.3 种子播种萌发 将ga-1,ga-2,ga-3的种子播种在含有GA310-6mol/L的PNS固体培养基上,分别在光下和暗中萌发。观察并统计其萌发率。 1.4 种子萌发率的测定 GA缺陷型突变体ga-1,ga-2,ga-3的种子播种在含有不同浓度(10-4～ 10-8mol/L)GA的培养基上于黑暗及光照条件下培养,观察并统计其萌发率。 1.5 不同质量分数的tis-鳌酸盐adp 反应混合液中含 0.1 ml Tris-HCl 200 mmo1/L (pH 7.4)、 0.1 ml磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)15 mmol/L。0.1 ml ADP 25 mmol/L,0.1 ml KC1 500 mmol/L,0.1 ml Tris-钼酸盐l2.5 mmol/L, pH 7.4, 2.3 ml蒸馏水,酶液0.2 m1(相当1 mg蛋白质)。对照不加ADP以蒸馏水代替,在37℃下反应10 min后,加入1 m1 2,4-二硝基苯肼,再加入1.2 ml含有EDTA 2.0×10-3mol/L的2.4 mol/L的NaOH,放置10 min,在510 nm波长下测定0D值,以ΔOD mg-1protein min-1表示酶活性。 1.6 -二氯-差异酚模型 反应混合液中含0.1 m1磷酸钾 1.5 mo1/L(pH 7.4),0.1 ml 琥珀酸钠1.2 mol/L(pH 7.4), 0.1 ml 2,6-二氯酚靛酚钠(2,6-DCPIP) 9×l0-4mol/L及2.5 ml蒸馏水。置30℃水浴中保温。测定酶活前加入0.1 ml的酶液(相当1 mg蛋白质)和0.1 ml硫酸甲酯吩嗪9 mg/ml,反应开始后15～60 s时在600 nm处测定OD值,用蒸馏水作对照。以ΔOD mg-1protein min-1表示酶活性。 1.76 -磷酸葡萄糖脱氢酶活性测定 依照欧阳光察(1985)的方法测定。 2 结果与讨论 2.1 -氧代戊二酸盐系对ga-1和3 试验了烯效唑和pohexadione两种GA合成抑制剂。我们观察到烯效唑10-5mol/L几乎完全抑制ga-i种子的萌发,当加入外源GAs时抑制作用被部分解除,有趣的是GAs对萌发的恢复效果可因光照而得到显著的促进(图1)。prohexadione是GA生物合成途径中依赖2-氧代戊二酸盐的加双氧酶的抑制剂,与烯效唑实验不同之处是先让ga-i种子在黑暗中吸涨36 h,然后播种在含prohexadione 10-4mol/L的固体培养基上,从图2可以看出,prohexadine明显抑制种子的萌发,而加入外源GA3可以解除prohexadione的抑制作用。与图1的结果相似。上述结果表明GAs对抑制剂抑制萌发的恢复效果可