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飞解释dna的快速抽提及其在遗传进化分析中的应用 广泛分布于东半洲，被称为九个亚洲（康乐等人，1991）。我国飞蝗有3个亚种:东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis、亚洲飞蝗L.m.migratoria和西藏飞蝗L.m.tibetensis。西藏飞蝗分布于西藏和青海省部分地区;亚洲飞蝗分布于新疆、内蒙古和东北等地区;而东亚飞蝗则广泛分布于我国东部和中部的地区(康乐等,1989)。 RAPD是Williamset al.(1990)和Welshet al.(1990)同时发明的一种DNA分子水平上的检测技术。具有简单、快速和试验费用较低等优点。但是RAPD仍存在一些问题(Black,1993),主要是某些反应条件稍微改变就会影响到试验结果(陈永久等,1997;汪小全等,1996;Williamset al.,1993),不同实验室之间难以重复研究结果。在昆虫学研究领域,RAPD技术已应用于昆虫种、株系、生物型以及父系的鉴定,连锁图谱的构建,系统演化,种群遗传学,杂交带的确定等。为了研究我国散居型飞蝗不同地理种群DNA多型性,确定3个飞蝗亚种的进化、起源关系,我们用RAPD技术,在优化条件下初步分析飞蝗种群及亚种间的亲缘关系。试图摸索出一套抽提飞蝗总DNA的快速、简便的方法,对影响RAPD分析结果的某些因素进行了试验。现报道如下。 1 材料和方法 1.1 古可式诉讼—试验材料 试验所用飞蝗均采集于田间,群居型和散居型的东亚飞蝗采集于天津北大港。亚洲飞蝗采集于内蒙巴彦淖尔盟(简称“巴盟”)乌拉特前旗。西藏飞蝗采集于西藏拉萨、日喀则。每地理种群取10头个体用于RAPD分析。 1.2 细胞剂 参照Cooperet al.(1993)方法加以改进:低温冻结活虫,去其胸翅,体表酒精灯火焰灭菌3～5 s后,去除内脏。每头加5～10 mL 4℃预冷的研磨液[0.1 mol/L?NaCl,0.01 mol/L?EDTA(pH8.0),0.3 mol/L?TrisHCl(pH8.0),1%SDS]磨细。加蛋白酶K至50 μg/mL,37℃过夜。酚氯仿抽提离心上清液,冷冻异丙醇和NaAc室温下沉淀DNA,灭菌Tip头挑出沉淀,70%乙醇洗涤,稍干后溶于去离子水中。加RNA酶至10 μg/mL,37℃ 2～3 h。2次酚氯仿、1次氯仿、1次无水乙醚抽提,冷冻无水乙醇和NaAc室温下沉淀,用灭菌Tip头将沉淀挑出,70%乙醇洗涤3次,稍干燥沉淀,溶于去离子水中。稀释后的模板在4℃下贮存使用。 1.3 引用产品 采用美国Operon公司生产的10 Mer随机引物。 1.4 taq酶taq-pcr 本试验中,RAPD反应条件是:总反应体积为25 μL,其中含有2.0 mmol/L?MgCl2,dNTP 0.1 mmol/L(Promega产品),引物0.2 μmol/L,1 U?Taq酶(北农大产品,Taq酶Buffer成分未公开),20 ng模板DNA,每反应管加2滴矿物油(Sigma产品)。每个反应为45个循环,每个循环包括在循环之前94℃预变性4 min,然后94℃ 1 min,36℃ 1 min,72℃ 2 min,45个循环,72℃延伸7 min。使用PE480 PCR仪。 1.5 ffer电泳 扩增后每反应管加5 μL?Loading Buffer,混匀,取10～15 μL于1.4%琼脂糖凝胶2.5 V/cm电泳3～4 h。用STRATAGENE Eagle EyesⅡ扫描成像。 1.6 upgm聚类分析 将RAPD扩增的带转换成0/1数据,用RAPDPLOT以及PHYLIP3.5c程序中的NEIGHBOR进行5个种群所有个体的UPGMA聚类分析;用RAPDDIST以及PHYLIP3.5c程序中的NEIGHBOR和CONSENSE进行3个亚种的UPGMA聚类分析及Bootstrip分析。 2 结果和讨论 2.1 rapd基因信息分析 尽管RAPD分析时对模板要求不是很高,但仍需要高分子量的模板。Henryet al.(1990)介绍了一种抽提昆虫高分子量DNA的方法,但此方法对抽提条件要求较严格。我们曾用长期贮存的干标本抽提总DNA,抽提产物电泳呈弥散状,RAPD结果也呈弥散状,这可能是干标本在长期储存中DNA严重降解所致。因此,我们认为飞蝗干标本不适合用于RAPD分析,也许长时间贮存的所有昆虫干标本都不适合用于RAPD分析。改用活标本及浸泡在无水或95%乙醇中-20℃(短期贮存)或-80℃(长期贮存)冷冻的标本都可得到质量较好的总DNA。研磨比较充分的标本可以获得较高的DNA产量。沉淀DNA用Tip头挑出,可以减少DNA中的小分子DNA片断及RNA,有利于RAPD的可重复性(Micheliet al.,1994)。