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猪肌纤维的分类及在体外培养中的应用 肌肉纤维是肌肉的基本组成单位。近年来对肌纤维特性的研究表明,肌纤维的组织学特性与肌肉品质特别是食用品质(嫩度、风味、多汁性)性状密切相关,肌纤维的特征在某种程度上决定了肌肉特性。从表面上来看,评价肉质的指标反映了肉品质某个方面的物理化学特性,但进一步的分析表明,这些指标并不是相互独立的,而是密切相关的,而联系这些指标的一个重要的生理过程即是肌肉肌纤维类型的分布及其转化。研究肌纤维类型的分布及其转化规律对探讨动物生长、肉品质的形成有着重要意义。 1 肌纤维的组成及主要成分 肌纤维是构成骨骼肌的基本单位。肌纤维源自胚胎期中胚层干细胞分化形成的成肌细胞,成肌细胞相互融合形成肌管,肌管再转变为肌纤维。肌纤维为细长圆柱形的多核细胞,每条肌纤维由肌膜、肌浆、细胞核及大量肌原纤维组成。肌原纤维主要成分为肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白。 肌球蛋白对肌纤维类型的形成具有重要作用。肌球蛋白是骨骼肌细胞中表达最多的蛋白,它代表了一类由高度保守的多基因编码的同功能蛋白家族,是骨骼肌主要的收缩蛋白,可利用ATP产生机械能。而骨骼肌功能上的差异,主要是由于收缩蛋白和代谢蛋白的多样性造成的。近年来通过基因克隆、聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳和抗肌球蛋白重链单克隆抗体进行免疫组化实验,发现许多新的肌球蛋白重链和肌纤维类型。 2 肌肉纤维法 2.1 肌球蛋白酶组化类别 根据肌肉的颜色将骨骼肌纤维分为红肌和白肌两种类型,红肌收缩较慢,白肌收缩较快;根据收缩机能将肌纤维分为慢肌和快肌。根据颜色、收缩特性和代谢特征可将肌纤维分为慢肌纤维(色红,收缩慢,进行有氧代谢)、快红肌纤维(色泽较红,收缩快,进行有氧代谢)和快白肌纤维(色白,收缩快,进行酵解代谢);也就是分为βR,aR 和 aW(β:slow-twitch;a:fast-twitch;R:red;W:white)3种。早期的命名大部分是根据组织切片染色法进行鉴定的,这类方法包括三磷酸腺苷酶(ATP)染色法、琥珀酸脱氢酶(SDH)染色法和酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶(NADH-TR)染色法。 在组织切片染色法的基础上又提出了肌球蛋白酶组化分类法,根据肌球蛋白ATP酶对酸碱稳定性的不同分别将肌纤维分为β,a,aβ或Ⅰ,Ⅱa,Ⅱb 3种类型,根据ATPase的活性把Ⅱ型又分为3个亚型:ⅡA(快速收缩氧化型)、ⅡB(快速收缩酵解型)和Ⅱc(中间型)。根据肌纤维收缩速度和代谢特征的不同,将其分为快缩氧化型、慢缩氧化型、快缩氧化酵解型及快缩酵解型纤维,也就是根据代谢特点将肌纤维划分为氧化型(I型)、氧化酵解型和酵解型(Ⅱ型)。慢收缩氧化型纤维是红肌纤维,快收缩氧化酵解型纤维是中间型纤维,快收缩酵解型纤维是白肌纤维。鉴定这类肌纤维的方法主要是测定肌原纤维ATP酶、琥珀酸脱氢酶或乳酸脱氢酶的活性。 随着对肌纤维类型研究的深入,近年来发现肌纤维ATP酶的pH 倾向和肌纤维肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的异构体间存在某种相关性,并在对啮齿类和人类的研究中确认了与肌纤维类型相对应的4种MyHC类型。CHANG等人1997年确定了 MyHC Ⅰ,2a,2b 和 2x 在猪的骨骼肌中的表达,并依据肌纤维特有的 MyHC 类型将猪的肌纤维分为4种类型:慢速氧化型(Ⅰ型)、快速氧化型(2a 型)、快速酵解型(2b 型)和中间型(2x 型)。随着研究的深入,在哺乳动物的骨骼肌和心肌中共发现8种异构体,在成年哺乳动物骨骼肌中表达的有4种类型:Ⅰ,2a,2b和2x。而且有研究表明,在正常成年动物肌肉的同一纤维中快肌球蛋白和慢肌球蛋白能共同存在。不同肌球蛋白组成的肌肉能表现出不同的收缩能力和ATPase活性,所以目前肌球蛋白重链亚型已成为区分肌纤维类型和研究肌纤维适应性的分子标志,深入观察分析肌纤维分子成分的变化和差异性。近年来,随着分子生物学技术在在生命科学研究领域的广泛应用,采用半定量PCR或荧光定量PCR方法,检测不同类型肌纤维肌球蛋白重链mRNA基因的表达量可准确、可靠地对肌纤维类型进行分类,并已普遍得到认可和应用。 尽管对不同类型肌纤维的命名有所不同,但相互之间具有较高的相关性(见表1)。 2.2 形态和代谢方面 目前常用的肌纤维分类方法是根据MyHC 类型将肌纤维分为MyHC Ⅰ,2a,2b 和 2x 4种,按照氧化代谢能力由高到低依次为Ⅰ型、2a型、2x型、2b型,而各类肌纤维根据氧化代谢能力的不同,在形态和代谢方面各有特点(见表2)。 Ⅰ型为有氧代谢型肌纤维,含有更多的线粒体和细胞色素,浆膜中红色的肌球蛋白含量高,因而外观呈红色,收缩缓慢而持久,因而又叫红肌纤维或慢缩纤维;2b 型为酵解代谢型肌纤维,细胞色素和肌红蛋白含量均较少,外观呈白色,收缩快但持续时间