响应面法优化vc二步发酵法产2-酮基-l-火龙果酸发酵培养基.docxVIP

响应面法优化vc二步发酵法产2-酮基-l-火龙果酸发酵培养基 lc是含有6个碳原子的多甲基酸，也被称为l-抗坏血酸（l-ascorbicacid）。参与体内多种羟化及氧化还原反应,具有抗氧化性、提高机体免疫力、解毒、抗癌等作用,被广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料等行业。VC二步发酵法是由我国自主研发的生物发酵法,主要由醇糖转化以及糖酸转化两步组成,其中第二步转化反应由两种细菌混合发酵完成,产酸菌为氧化葡萄糖酸杆菌,单独培养生长缓慢,传代困难,且产酸能力很弱;伴生菌为芽孢杆菌,易培养,不产酸,但与产酸菌混合培养可促进产酸菌生长及产酸,已经发现多种菌种均可以作为伴生菌,例如:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、条纹假单胞菌(Pseudomonas striaia)、掷孢酵母(Sporoblomyces roseu)等。但目前VC生产菌系较单一、生产菌种的转化率难以大幅度提升、原料利用率偏低,因此国内外学者不断进行技术革新,并致力于筛选转化率高、发酵速率快的优良菌系用于提高VC产量,进而提高设备利用率、降低生产成本。本实验室筛选到一株枯草芽孢杆菌具有很好的伴生能力,可以有效提高产酸量并且使发酵终点提前,糖酸转化率可达94%左右,既降低成本又提高生产效率,具有很好的应用前景。常规优化发酵培养基多为其他因素固定,每次只研究—个变化因素,这种研究方法效率低,且容易忽略因素间的交互作用而得出错误的结论,不能实现真正的最优化。响应面法是多变量系统寻优的试验策略,已成功应用于许多生物过程培养基和操作条件的优化。本实验采用响应面设计法的中心组合试验设计(central composite design,CCD)优化VC二步发酵培养基,最终得到较好的培养基配比,以提高2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)产量。 1 材料和方法 1.1 枯草芽孢杆菌 氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)与巨大芽孢杆菌2980(Bacillus megaterium 2980)均由东北制药总厂提供。枯草芽孢杆菌A9(Bacillus subtilis A9),由本实验室筛选并保藏。 基础发酵培养基(g/L):L-山梨糖80、玉米浆10、尿素12、KH2PO41、MgSO40.2、CaCO35,pH 6.7～7.0。 1.2 实验仪器 万分之一电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司;LDZX型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;数显恒温水浴锅江苏国华电器有限公司;HZP-250型全温振荡培养箱上海精宏实验设备有限公司;超净工作台苏州苏净集团安泰公司;UB-7型pH计北京丹佛仪器有限公司。 1.3 培训方法 1.3.1 菌混悬液配制 分别挑取大小菌到无菌水中,然后挑一环大菌悬液于小菌悬液中,摇匀制成大小菌混悬液。用灭菌的接种环蘸取一环大小菌混悬液于空白培养过的试管斜面上划线,如此反复15～20次,直至斜面表面湿润,倒置培养2～3d(29℃)。将混菌斜面接种于种子培养基中,于29℃、180r/min培养24h。 1.3.2 发酵和培训 将培养好的种液以10%的接种量转接至发酵培养基中,于29℃、180r/min培养48h。 1.4 分析 1.4.12-酮基-L-古龙酸测定 采用碘量法测定。 1.4.2 中心组合试验 单因素试验:通过固定其他成分而改变发酵培养基中一个组分(碳源、氮源、无机离子)的质量浓度,从而得出优化的发酵培养基,以上试验均采用的发酵条件为29℃、180r/min摇床培养48h。 在单因素试验的基础上,借助Design Expert软件,采用中心组合试验设计原理,选取L-山梨糖、尿素、玉米浆、CaCO3、MgSO4添加量为试验因素,以2-KGA产量为指标,进行响应面分析,试验因素水平设计见表1。 表1自变量编码方程为:xi=(Χi-Χ0)/ΔX,式中:xi为自变量的编码值;Χi为自变量的实际试验水平值;Χ0为试验水平中心点的实际值;ΔΧ为单变量增量。因此,编码值与真实值之间的关系为:x1=(Χ1-80)/10;x2=(Χ2-12)/2;x3=(Χ3-14)/2;x4=Χ4-4;x5=(Χ5-0.2)×10。根据中心组合试验设计方案进行试验,用统计软件Design Expert7.0对试验数据进行回归分析,可推测出最佳培养基添加量组合。 2 结果与分析 2.1 不同菌株的共生能力的比较 由表2可知,伴生菌B.subtilis A9的促产酸能力明显高于生产用伴生菌B.megaterium 2980。 2.2 单因素试验的结果 2.2.1 糖酸血量及糖酸转化率 由图