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改良的cab法优化核桃rapd-pcr反应体系 坚果是坚果科的一个发展科。该成员主要是重要的经济树种。核桃不仅可以生产出高成本的坚果，而且可以木材材料好、生长快的特点。核桃属植物在全球的栽培历史久远,种质资源极为丰富,约有21个种,是一个非常重要的用材和坚果经济树种之一。美国白核桃J.cinerea,也叫白核桃、灰核桃、油核桃或柠檬核桃,是一种短期生长、耐寒、速生的用材和经济树种,可以生产优良木材,果实可以食用并可榨油。20世纪70年代,该树种受到一种外来病菌Sirococcus clavigignenti-juglandacearum的危害,已濒临灭绝。日本核桃J.ailantifolia,又称为心核桃,源产于日本和库页岛,1870年被引入美国。美国黑核桃J.nigra通常也称为东方黑核桃或者美国核桃,为经济价值较高的用材树种,在我国栽培十分广泛。我国核桃属植物栽培历史也十分悠久,在长期进化与栽培过程中,表现出了一些特有的优良性状,如孤雌生殖、早实、丰产和抗性强等。目前,我国主要栽培的核桃品种有以下6个种:分别是核桃J.regia、铁核桃J.sigillata、美国黑核桃J.nigra、麻核桃J.hopeiensis、胡桃楸J.mandshurica和野核桃J.catheayensis。 随着分子生物学的发展,20世纪90年代后DNA分子标记开始广泛应用于植物分子遗传育种、分子进化等研究领域。DNA分子标记是DNA分子水平上遗传多态性的直接反应,表现为核苷酸的差异。随机扩增多态性DNA分子标记(Randomly Amplifi ed Polymorphic DNA),简称RAPD,常常呈共显性遗传。应用RAPD分子标记技术进行物种品种鉴定,方法简单、快捷、可靠,不需要任何前期DNA模板信息。国内外也曾报道有RAPD技术在核桃属植物核桃的研究和应用。但是针对美国白核桃、美国黑核桃、日本核桃和杂种核桃的RAPD-PCR反应体系报道较少。DNA的提取和RAPD-PCR反应体系的优化,是对核桃属植物进行遗传育种等分子生物学研究必须首先解决的关键问题之一。本研究的目的:(1)以美国白核桃、美国黑核桃、日本核桃和杂种核桃为试验材料,研究优化从叶片中提取基因组总DNA的方法和步骤。(2)进一步研究以上几个核桃属植物RAPD反应体系中各种组分的浓度、PCR反应的温度和反应程序等对PAPD-PCR扩增的影响效果,找出适合以上几个树种的RAPD-PCR反应体系的优化方案,从而为核桃属植物在分子水平开展的相关研究奠定良好基础。 1 材料和方法 1.1 种质资源和样品采集 美国白核桃和杂种核桃试验样品来源于美国不同州和地区的马特尔(Martell)核桃遗传育种试验地;日本核桃采集于美国加州国家种质资源中心;美国黑核桃样品采集于印第安纳州巴特勒维尔(见表1)。4月份从健康植株上采集嫩芽,5月份从健康植株上采集当年生新鲜嫩叶2~3片(单株),放入标记好的塑料袋中,用保温箱迅速运回实验室,保存于4℃冰箱中,备用。 1.2 测试方法 1.2.1 高效液相研磨法 DNA的提取与分离参照Doyle and Doyle等人提出的CTAB法,并在此基础上进行了改良。称取约100 mg新鲜叶片,去除叶脉(或者采用干叶片),放入2 mL screw-cap试管中,并加入2粒0.5 cm大小的硬珠豆(Bio 101-Savant,Carlsbad,CA,USA),再加入1 mL CTAB提取缓冲液。缓冲液包括2%CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide),50 mmol/L TrisCl,20 mmol/L EDTA,pH值8.0,1.4 mol/L NaCl,0.4 mol/LLiCl,2%PVP(polyvinylpyrrolidone),2%SDS。然后用快速离心机研磨,研磨之前迅速加入β-疏基乙醇(β-Mercaptoethanol,2%)。将样品在研磨机(Fast Prep 120,Bio 101-Savant,Carlsbad,CA)转速为55的速度下混匀,40 s 3次,每次间隔期间将样品放到冰上冷却3 min。研磨之后,将样品放到65℃的杂交炉中匀速旋转,过夜后取出样品,加入400μL氯仿并轻轻混匀,室温13 000 r/min离心5 min。取上清液置1.5 mL离心管中,加入450μL混合液(V苯酚∶V氯仿∶V异戊醇=25∶24∶1)后轻轻混匀,室温13 000 r/min离心10 min。取上清液置1.5 mL离心管中,加入400μL氯仿并轻轻混匀,室温13000 r/min离心5 min(重复2次)。再取上清液置1.5 mL离心管中,加入90%的冷却异丙醇(4℃)和10%的醋酸钠(3 mol/L NaAc,