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土荆皮酸对体外培养hela细胞的增殖抑制及凋亡作用机制研究

宫颈是最常见的妇科肿瘤，死亡率很高。主要死亡原因是复发和抗癫痫药物，包括顺铂。因此寻找新的更有效的药物是非常必要的。土荆皮酸(pseudolaricacidB,PAB)是从荆树皮(Chinesegoldenlarchbark)中提取的一种二萜类化合物,可以诱导多种肿瘤细胞发生细胞凋亡。Tan等发现PAB通过抑制血管新生过程来抑制肿瘤的形成及发展。但PAB对抗宫颈肿瘤的机制还未见相关的研究报道。为进一步研究PAB对宫颈癌的影响,本研究以人宫颈癌HeLa细胞作为对象研究PAB对体外培养的宫颈癌HeLa细胞株的生物学效应,并探讨其可能的作用机制。

材料和方法

1主试剂

2细胞生长和细胞培养

2.1细胞培养人宫颈癌细胞株HeLa细胞购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。人宫颈癌HeLa在含有10%胎牛血清,1%青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中,37℃、5%CO2保持饱和湿度培养。

2.2MTT法取对数生长期的HeLa细胞接种于24孔培养板,每孔细胞数5×104/mL,待细胞贴壁,加入不同浓度(2.5、5、10、20μmol/L)的PAB,每组3个复孔。并设对照孔,置37℃、5%CO2培养箱,培养至预定时间,加入0.5%MTT100μL/孔,继续培养5h,弃上清,加入DMSO1mL。微震荡至结晶溶解,用Bio-TEK公司的ELX-800酶标仪在490nm处测定吸光度,并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1-实验孔平均值/对照孔平均值)×100%。本实验重复3次。

2.3流式细胞术对数生长期细胞接种于直径6cm培养皿。细胞量1×106,培养基5mL,细胞贴壁后加入10μmol/L的PAB。至预定时间,收集悬浮与贴壁细胞,PBS清洗后,用预冷的70%乙醇固定。上机前用碘化丙锭(PI)染色,以流式细胞仪进行DNA含量及细胞周期分析。所用软件为ModFTT,本实验重复3次。

2.4透射电镜观察细胞培养方法同上。至预定时间后收集所有培养细胞,密度1×106/mL,用2%戊二醛4℃固定,然后用1%锇酸固定,再常规乙醇脱水包埋,超薄切片,醋酸钠和柠檬酸铅双重染色后透射电镜观察。

2.5RT-PCR细胞培养方法同上,至预定时间后收集贴壁细胞,用Trizol法抽提总RNA,定量后按照试剂盒说明操作,将mRNA逆转录成cDNA,在BiometraTGradientPCR仪上进行PCR:95℃9min热启动后按下列条件扩增:90℃30s;60℃30s;72℃1min。循环次数及引物序列见表1。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳,然后用Bio-Rad公司生产的Fluoro-S凝胶检测系统检测照相,最后以GAPDH为内对照扫描分析。

3统计方法

pab作用时间对hela细胞细胞周期的影响

1PAB抑制HeLa细胞增殖用MTT法检测PAB对HeLa细胞作用24h后的增殖抑制作用发现,PAB对HeLa细胞的增殖抑制呈剂量依赖性关系。2.5、5、10、20μmol/L的PAB对HeLa细胞的抑制率分别为13.81%、43.36%、51.05%、60.19%。IC50为10μmol/L。

210μmol/LPAB作用不同时间后HeLa细胞细胞周期分布及凋亡情况(表2)流式细胞仪分析结果显示,10μmol/LPAB作用HeLa细胞0、24、48、72h后,随着作用时间的延长,一方面降低G0/G1期的细胞比例,另一方面增高G2/M期细胞的比例。

3电镜结果可以看出,PAB作用后HeLa细胞胞质浓缩,染色质浓集,附于核膜下,属于细胞凋亡的表现之一。

410μmol/LPAB对HeLa细胞bax基因、bcl-2基因mRNA表达的影响(表3)RT-PCR结果显示,PAB作用后,HeLa细胞显示bax上调,并以作用48h最显著,同时bcl-2的表达随作用时间延长而逐渐下调(48h内),p53则未检测到表达。

pab的调节作用

PAB是从荆树皮中提取的一种二萜类化合物,临床广泛用于真菌感染的治疗并具有抗生育活性。新近研究发现PAB可以抑制肿瘤血管生成,并在一些肿瘤细胞系中有诱导凋亡的作用,但是关于PAB抗人宫颈癌作用的机制尚未阐明。

PAB对卵巢癌HeLa的细胞毒作用首先表现为抑制增殖。MTT法检测显示PAB在适当浓度下对宫颈癌HeLa细胞有较强的细胞毒作用,在体外作用24h的IC50约10μmol/L。而且,PAB对HeLa细胞增殖的抑制作用随浓度增高而明显增强。流式细胞术结果则显示10μmol/LPAB作用0～72h后,呈时间依赖性改变细胞周期分布,一方面降低G0/G1期的细胞比例,另一方面增高G2/M期细胞的比例,提示PAB通过将