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白介素-22和s100a7,a6,a7mrna在寻常型银屑病中的表达及关系

21岁。2000年代，杜莫蒂等人首次从il-9刺激的bw5147肿瘤细胞中发现。它和IL-10,IL-19,IL-20,IL-24及IL-26同属IL-10家族的细胞因子。IL-22主要由活化的T细胞尤其是T1细胞和NK细胞产生,它能上调肝癌细胞中的急性期蛋白的表达和胰腺腺泡细胞中胰腺炎相关蛋白-1的表达。同时,有研究显示在T细胞介导的炎症性皮肤病的皮损中检测到IL-22的高表达。S100A7,A8,A9是S100蛋白家族成员,S100蛋白是一类EF-手相钙结合蛋白,其基因位于染色体1q21表皮分化复合体区域内,提示其在角质形成细胞的分化和增殖中发挥作用。本研究采用RT-PCR技术检测了银屑病患者皮损中IL-22和S100A7,A8,A9mRNA的表达,结果报告如下。

1pcr和taqcda的合成

1.1研究对象35例寻常型银屑病患者均为临床与组织病理学检查确认的典型进展期病例。男20例,女15例,年龄18～71岁,病程1个月～6年,其中20例为首发患者,未经任何治疗,另15例患者近3个月内未接受系统治疗和外用药治疗,且无其他免疫异常性疾病。16例正常人皮肤组织,男9例,女7例,均排除银屑病且无系统性疾病和其他皮肤病史。患者皮损和正常人皮肤组织取材部位均为躯干部,取材后标本一部分送常规组织病理检查,另一部分立即液氮速冻,

-70℃保存备用。

1.2主要试剂与仪器Trizol购自Invitrogen公司,逆转录试剂盒购自Fermentas公司,紫外分光光度计(美国Promega公司),DL2000购自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1引物的合成IL-22,S100A7,S100A8,S100A9及内参β-肌动蛋白引物由上海英骏生物技术有限公司合成,引物序列见表1。

1.2.2总RNA提取和cDNA合成取皮肤组织标本50mg加1mLTrizol,严格按照试剂说明书提取总RNA。提取出的总RNA用紫外分光光度计测定其纯度A260/A280为1.7～1.9,同时经琼脂糖凝胶电泳,显示明显的28S,18S两条带。取总RNA1μg,按逆转录试剂盒RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase说明书进行cDNA合成,-20℃保存。

1.2.3PCR反应反应体积为25μL,包括10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl21.5μL,10mmol/LdNTPs2μL,10μmol/L上游和下游引物各1.5μL,cDNA2μL,TaqDNA聚合酶1.0μL,双蒸水13μL。扩增条件:预变性94℃,2min,变性94℃,30s,退火温度和时间各因子不同(IL-22:退火52℃,35s;S100A7:退火58℃,35s;S100A8:退火51℃,35s;S100A9:退火60℃,35s);延伸72℃,40s;共32个循环,最后72℃延伸5min。同时以β-肌动蛋白作内参照。每次均设阴性对照,阴性对照管中不加cDNA,以双蒸水代替模板,其他同实验组。PCR在PTC-100型PCR仪(MJ公司)上进行,反应产物均取10μL于1.5%琼脂糖凝胶稳压电泳,在紫外灯下观察结果并摄像。

1.3图像分析和数据处理用β-肌动蛋白作内参照,对IL-22和S100A7,A8,A9mRNA进行半定量,采用上海四星公司图像分析系统对每组标本IL-22和S100A7,A8,A9以及β-肌动蛋白的扩增产物进行分析,分别计算出IL-22和S100A7,A8,A9与β-肌动蛋白的相对比值(即IL-22/β-肌动蛋白,S100A7/β-肌动蛋白,S100A8/β-肌动蛋白和S100A9/β-肌动蛋白),以此代表IL-22和S100A7,A8,A9mRNA的相对水平。所得数据用SPSS12.0软件进行t检验(方差齐时)或校正t检验(方差不齐时)和直线相关分析,求相关系数r。

2结果

2.1pcr扩增il-32mrna

通过1.5%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,选用DNA标记作为分子量标准,IL-22mRNA扩增片断为113bp,S100A7为226bp,S100A8为191bp,S100A9为240bp,β-肌动蛋白为318bp,与理论设计相符(图1～4)。

2.2嘴唇嘴唇型充填患者皮肤组织形态的变化比较

见表2。S100A7在寻常型银屑病患者皮损及正常人皮肤组织中均表达,但在寻常型银屑病患者皮损中的水平较正常人皮肤组织明显升高(t=18.374,P0.01)。IL-22和S100A8,S100A9在寻常型银屑病患者皮损中呈阳性表达,而在正常人皮肤组织中