苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法.docxVIP

SN/T3069—2011

苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了植物检疫中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫整定方法。

本标准适用于来自苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌发生国家或地区相关寄主新鲜果实中的苹果和梨

果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

SN/T2077进出境苹果检疫规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

子实体fruithody

无论是无性繁殖或有性繁殖，结构简单的或复杂的真菌产孢机构，统称为子实体。

3.2

分生孢子器sporudochidium

半知菌球壳孢目真菌形成的一种子实体，球形或瓶形，产生分生孢子。

3.3

分生孢子condidium

半知菌的分生孢子着生在散生，束生的分生孢子梗或分生泡子座上，或着生在分生孢子盘或分生孢

子器内。分生孢子的形态变化很大，大致可分为7种类型。

4方法原理

4.1分类地位

英文名：SphaeropsisRot

学名：SphaerupsispyriputrescensXiao1.D.Rogers2004

苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌属真菌界(Fungi),半知菌亚门(Deuteromyeotina),腔菌纲(Coelo

mycetes),球壳孢目(Sphaeriales)。

4.2检疲鉴定依据

以病菌在寄主上的症状特点，病菌形态学特征及其培养特性、病菌种的特征以及基因组序列作为苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定依据，必要时辅助进行致病性测定(见附录A.附录B.附录C、

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附录D)。

5设备及用具

5.1仪器设备

体视显微镜、生物显微镜、电子天平(感量0.01g)、高压灭菌器、超净工作台、生物培养箱(带荧光

灯)、高速离心机、PCR仅、实时荧光PCR仪、凝胶电泳和成像系统。

5.2实验用具

标签、定性继纸、样品装、保鲜袋、手持放大镜、镊子、解剖刀、酒精灯、接种针、培养皿(直径9.0cm)、烧杯(500mL)、量筒(500ml.)、三角瓶(250mL)、载玻片、盖玻片、微量移液器(可调式范围：2.5gL~1000pL)、移液器枪头(10pL、100pl.,1000pL)。

6试剂和培养基

6.1试剂

1%NaClO溶液，无水乙醇，70%乙醇，无菌双蒸水，2%CTABDNA提取缓冲液、10%SDS溶液、3mol/L.醋酸的溶液、PCR试剂《包括Tag聚合酶、dNTP、缓冲液》、实时荧光PCR混合液、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCl、EDTA、ITS引物，实时荧光PCR引物和探针、琼脂糖，DNA相对分子质量标准(DL2000Marker),0.5×TBE电泳缓冲液。

6.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(见附录A)。

7标准菌株

SphaeropsispyripntrescensXiao.J.D.Regers

8抽样

口岸查验进境水果时，按SN/T2077对来自疫区的苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌寄主的新鲜果实

进行抽样与取样。

9检验方法

9.1现场检验

将有明显病症病果置于体视显微镜下检查，或直接挑取病部病原体制成玻片，置于生物显微镜下检

查，观察记录有无病菌的分生孢子座、分生孢子器以及分生孢子的形态特征和着生方式，并测量其大小。

9.2实验室检验

9.2.1显微镜检

将有明显病症病果置于体视显微镜下检查，或直接挑取病部病原体制成玻片，置于生物显微镜下检

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查，观察记录有无病菌的分生孢子座，分生孢子器以及分生孢子的形态特征和着生方式，并测量其大小。

9.2.2保湿培养

如病果上只有可疑病状面无明显病症，则将病果置于样品袋中，于20℃~25℃下保湿培养.定期观察症状的变化，并进行显微镜检或分离培养。

9.2.3分离培养性状和形态学观察

取可疑病果用70%的乙醇表面消毒，超净工作台上自然干燥，取病健交界的组织数块(大小约

5mm×5mm.置于PDA平板上，于20℃~25℃黑暗下近紫外灯下培养.待菌落出现后观察菌