SNT 3495-2013 牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T3495—2013

牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法

Protocolofthereal-timePCRfordetectinggeneticallymodifiedcomponentincowsandtheirderivedproducts

2013-03-01发布2013-09-16实施

中国家华质量人监督民检检总发布

SN/T3495—2013

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中国农业大学、北京市畜牧兽医总站、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘建、朱振营、贾广乐、吕继洲、林祥梅、王建武、郑海松、薛振华、王慧煜、冯春燕、廖娟红、王建峰。

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SN/T3495—2013

牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了牛及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR检测方法。

本标准适用于转人乳铁蛋白基因奶牛、转人α-乳清白蛋白基因奶牛、转人溶菌酶基因奶牛及肉制品、奶制品等转基因成分实时荧光PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

β2m:β2微球蛋白(β2-microglobulin)。bp:碱基对(basepair)。

CMV:巨细胞病毒(cytomegalovirus)。

Ct:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(cyclethreshold)。dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)。

dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycyticinetriphosphate)。

dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate)。dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)。dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)。

DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。

GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein)。

hLA:人乳清蛋白(huamanlactobumin)。hLF:人乳铁蛋白(huamanlactoferrin)。hLY:人溶菌酶(huamanlysozyme)。

NPTⅡ:新霉素-3-磷酸转移酶基因(neomycin-3-phosphotransferasegene)。SV40:猿猴空泡病毒40(SimianVacuolatingvirus40)。

PCR:聚合酶链反应(polymerasechainreaction)。Taq酶：聚合酶(DNA)。

TE:Tris-Hcl、EDTA缓冲液。

Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)。

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SN/T3495—2013

4实验方法

4.1主要仪器

4.1.1实时荧光定量PCR仪。

4.1.2超净工作台。

4.1.3核酸蛋白分析仪。

4.1.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。

4.2主要试剂

除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。

4.2.1实验用水：应符合GB/T6582中一级水的规定。

4.2.2PCR缓冲液。

4.2.3氯化镁(MgCl?)。

4.2.4dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)。

4.2.5Taq酶。

4.2.6其他药品及试剂配制方法见附录A。

4.3引物和探针

按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，加入无离子水配成100pmol/pL贮存，配成

直接用于PCR反应的10pmol/μL的工作液。

表1检测转基因动物内外基因所需的引物序列

被检测基因

基因来源

引物序列

探针序列

备注

牛β2m

内源

5-CTGCTATGTG