基因表达的检测PPT课件.ppt

2.操作过程样品制备：收集细胞PBS洗涤并离心沉淀细胞加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟高速离心，取上清（蛋白溶液）加入等量2XSDS－PAGE样品缓冲液煮沸5分钟后上样（或保存于－20℃）制胶（不连续缓冲胶系统）：胶的成份：压缩胶分离胶当前您正浏览第三十一页，共七十四页。胶浓度的选择：丙烯酰氨浓度蛋白线性分离范围/KDa1512107.5510－4312－6020－8036－9457－212加样与电泳：加适量的样品（200－1000ug总蛋白量）、对照及蛋白分子量marker180－200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳装置）当前您正浏览第三十二页，共七十四页。凝胶染色：考马斯亮蓝（R－250）染色银染印迹转移：原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上4℃条件下，300mA电泳1－3小时（Bio-Rad电泳装置）封闭：5%脱脂牛奶或5%BSA，室温下1小时（或4℃过夜）一抗反应：选择合适的第一抗体适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应当前您正浏览第三十三页，共七十四页。二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应加生色底物显色HRP的底物：生色：4－氯－1－萘酚/H2O2发光：ECL溶液（鲁米诺/4－碘代酚/H2O2）AP的底物：生色：氮蓝四唑/5－溴－4氯吲哚磷酸发光：AMPPD拍片或曝光、洗片当前您正浏览第三十四页，共七十四页。0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrp53p21?-TubulinTimeafterirradiationDNAdamageinducesdown-regulationofhistonegenetranscriptionwhichparallelscellcyclearrest当前您正浏览第三十五页，共七十四页。优缺点：优点：不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实实验简单可靠、重复性好缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化对抗体的依赖度高应用：直接检测蛋白质的有无、变化可直接检测部分蛋白的功能与其它方法结合后，可检测蛋白－蛋白相互作用当前您正浏览第三十六页，共七十四页。酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：将可溶性蛋白质（单一组分或混合组分）固定于酶标板壁上－－抗原或抗体检测待检蛋白－－抗体或抗原固定物1Ab2AbE蛋白质（抗原）当前您正浏览第三十七页，共七十四页。2.操作过程（间接法、双抗体夹心法）样品处理：已知样品必须是可溶性蛋白－－溶于PBS、水等样品可以是单一组分或混合组分包板：适量的抗原以高PH溶液（PH7.6－7.8的碳酸盐缓冲液）或低PH溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板4℃反应1－2天PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期保存封闭：4%脱脂牛奶或4%BSA，室温下1小时（或4℃过夜）当前您正浏览第三十八页，共七十四页。一抗反应：选择合适的第一抗体适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应加生色底物显色：HRP的底物：H2O2/TMB终止：2MH2SO4结果判断：目测法仪器法当前您正浏览第三十九页，共七十四页。优缺点：优点：用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实方法简单（多样）、快速可大批量检测标本敏感性较高缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化特异性相对较低，重复性相对较差对所用抗体的依赖度高应用：大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化当前您正浏览第四十页，共七十四页。WhatisFlowCytometry?FlowCytometryisapowerfultechniqueforcellcounting,sortingandsurfacemarkeranalyzingFlowCytometrycanprovidequantitativeinformation