免疫组化实验方法.pptVIP

免疫组化实验方法免疫组织化学的概念*利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。最突出的优点*在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能。免疫组化实验标本*1组织标本（石蜡切片和冰冻切片）2细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂片）。3石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档；细胞和组织的固定1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。2．选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）组织新鲜勿干燥体积适中固定液足够（20倍）*抗体常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。特性比较：均一性2.稳定性 3.特异性4.重复性5.沉淀反应*能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。必备条件:荧光素标记抗体*01荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。02结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合物应无毒，附加抗原性小。常用的染色方法*按标记物定位于抗原所在部位的手段，则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥连法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法。根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法染色的基本程序*用缓冲液洗去未结合的成分；直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。标记抗体与标本中抗原反应结合；010203抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：反应条件抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：（1）PH：中性及弱硷性条件（PH7～8）有利于免疫复合物的形成（2）离子强度：0.01～0.02M的低离于强度有利于免疫复合物的形成（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），TritonX-100（0.1～1%）（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇*荧光素*1，异硫氰酸荧光黄（fluoresceinisothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。最常用。12四乙基罗丹明（tetraethylrhodamineB200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈橙红色荧光。价廉。3四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。染色注意事项*在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。酸碱度以接近体液环境为宜（PH7.4左右）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。