3.2.1目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptxVIP

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。从社会中来你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?

3.2基因工程的基本操作程序

一、目的基因的筛选与获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序：

1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。一、目的基因的筛选与获取

2.筛选目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。测序技术序列数据库（如GenBank）序列比对工具（如BLAST）测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。一、目的基因的筛选与获取

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。3.获取目的基因（1）从基因文库中获取目的基因一、目的基因的筛选与获取（基因序列已知）基因组文库部分基因文库（如：cDNA文库）cDNA文库：由mRNA逆转录产生的互补的DNA。

一、目的基因的筛选与获取①建立基因组文库：提取基因组DNA限制酶DNA片段与载体连接重组载体导入受体菌基因组文库

一、目的基因的筛选与获取②建立cDNA文库：成熟mRNA逆转录酶单链DNADNA聚合酶双链DNA（cDNA）与载体连接导入受体菌中储存cDNA文库

3.获取目的基因（3）利用PCR获取和扩增目的基因（已知目的基因的核苷酸序列，且基因较小）（2）人工合成法反转录法DNA合成仪DNA合成仪一、目的基因的筛选与获取

（聚合酶链式反应）原理：DNA半保留复制缓冲液一、目的基因的筛选与获取（3）利用PCR获取和扩增目的基因条件：PCR仪耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸分别与两条模板链结合的2种引物DNA模板（DNA聚合酶需要Mg+激活）

一、目的基因的筛选与获取思考：什么是引物？引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物；细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物。

引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端延伸子链。一、目的基因的筛选与获取思考：为什么子链合成需要引物？DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种（一对）引物。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）

比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶温度是否需要ATP结果联系DNA在高温下变性解旋细胞外（主要在PCR扩增仪内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶催化主要在细胞核内解旋酶、DNA聚合酶等细胞内，温和条件控制温度，需在不同温度下进行需要不需要合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料：4种脱氧核苷酸③酶：均需DNA聚合酶④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链

PCR所用原料实为脱氧核苷三磷酸dNTP一、目的基因的筛选与获取既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。脱氧腺苷三磷酸dATP脱氧鸟苷三磷酸dGTP脱氧胸苷三磷酸dTTP脱氧胞苷三磷酸dCTP

耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸引物待扩增的DNA片段3’3’PCR扩增过程变性温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。GC含量高，复性温度高

第一次循环90℃以上，DNA双链解开72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’50℃左右，引物与DNA结合

第二次循环5’3’5’5’3’5’高温变性、低温复性、中温延伸

第三次循环3’5’高温变性、低温复性、中温延伸

思考：至少要经过几次循环才能分离出目的基因？（两条脱氧核苷酸链等长的基因）三次

一、目的基因的筛选与获取思考：用PCR可以扩增mRNA吗？不可以！需要将RNA逆转录为cDNA，然后再进行扩增。单链RNA杂交