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第三章基因工程
第二节基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序：
(1)目的基因的筛选与获取;(2)基因表达载体的构建（核心）;
(3)将目的基因导入受体细胞;(4)目的基因的检测与鉴定。（P76）
一、目的基因的筛选与获取
1．目的基因的概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。（P76）
2.根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。（P76）
3.常见目的基因类型：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。（P76）
4．筛选合适的目的基因较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。（P76）
5.认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。（P77）
6.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？（P77相关信息）
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
7.为什么Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害？（P77相关信息）
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
8.获取目的基因的方法：PCR扩增、构建基因文库、化学方法人工合成。（P82）
9.PCR的概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（P77）
（1）全称：聚合酶链式反应。
（2）原理：DNA半保留复制。
（3）操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪）。
（4）目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
（5）优点：可以在短时间内大量扩增目的基因。
10.PCR由穆里斯等人于1985年发明，并于1993年获得诺贝尔化学奖。（P77）
11.条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。（P77）
12.PCR的过程：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列
结合；然后以单链DNA为模板在（耐高温的）DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。（P77）
(1)变性：温度上升到90℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。该过程中打开的是哪种化学键是氢键。（P78）
(2)复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。该过程碱基互补配对的一定是引物与模板链吗？不一定，也可能出现引物与引物配对（设计问题）、模板链配对。（P78）
(3)延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。（P78）
(4)重复循环多次。
(5)结果：呈指数形式扩增（n次扩增循环后，DNA数量约为2n)。
13.为什么呈指数形式扩增？
一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
14.DNA体内复制解旋条件为解旋酶，PCR解旋条件为90℃以上高温；
15.DNA体内复制合成DNA子链需要DNA聚合酶催化，PCR合成DNA子链需要耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）催化。
16.PCR的扩增缓冲液中一般含有Mg2+作用为激活DNA聚合酶。（P77相关信息）
17.PCR中复制的原料实际为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）除作为原料，还可以水解产生能量为合成DNA子链提供能量。因此，PCR反应体系中不需要添加ATP。
18.引物是一小段能DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（P77相关信息）*体内复制的引物为RNA单链，PCR中的引物一般为DNA单链。
19.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。（P77）
20.为什么需要引物？
DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链.
（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）
21.两种引物都结合在DNA模板链的3’端，脱氧核苷酸连接在引物的3’端进行延伸。
22.DNA新链延伸的方向为从5’端向3’端延伸。（P78图）
23.DNA复制需要一定
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