课题研究内容卫生网.pdfVIP

课题研究内容：

以我国现行《全血及成分血质量要求的指标》为主要判断依据，

参考欧美发达国家的相关技术标准、指南和科学文献，结合临床实验需求，制

定合适的评价指标体系提出有效的辐照手工分离白膜的产品成分功能实验，随

机选取60例健康全血的成品白膜平均分成两组，其中一半接受25Gy辐照。对

各组结果进行统计学分析。

研究方法：

1.白膜的

用塑料袋全血400mI，以1160g？离心6min，温度(22±2)℃，

离心后分出上层血浆至2号转移袋。将剩余血浆连同及靠近l.5

-2cm红细胞一起挤入1号转移袋，即为浓缩白细胞。

2.淋巴细胞的分离及其增殖活性的测定

2.1淋巴细胞的分离用PBS对倍稀释新鲜采制的白膜，混匀后以2：1的

比例加人Ficoll上层，离心700g，20min取中间细胞环，PBS洗3次后将PBMC

放60mm细胞培养皿中贴壁1h，吸取悬浮细胞即为以T淋巴细胞为主的淋巴细

胞。

2.2淋巴细胞增殖活性的测定取各组的淋巴细胞层，以5×104/孔细胞浓

度接种于96孔培养板，同时加入PHA20μg／ml,37℃、5％(v／v)CO2培养箱中

培养5天，加入MTT培养4h后离心，弃上清，结晶用二甲基亚砜（DMSO）溶

解，用酶标仪于波长570nm处比色，吸光度值。每个样品设3个复孔，96

，每孔加200μl对照组辐照组淋巴细胞悬液(培养液内含10μg／m1CD3单

抗和200U／mlIL-2)。每个样品设3个复孔，3个复均值作为实际值(A值)。

淋巴细胞抑制率=100％×(对照组A值-试验组A值)／对照组A值。

3.粒细胞的及功能检测

3.1粒细胞的：用PBS对倍稀释新鲜采制的白膜，混匀后以2：1的比例加

入Ficoll上层，离心700g，30min，吸弃上层单个核细胞，在余下的混悬液中加

入红细胞裂解液，37℃12min，250g15min洗2次。

3.2粒细胞的功能检测及其凋亡的测定

3.2.1吞噬功能：FITC荧光素01mg／ml标记DH5α细菌，悬浮于0.1mol／L

NaHCO，中，25℃60min避光，PBS洗后悬浮于其中。以10：1的比例加入培

3

养4h的粒细胞，并加入50μl人，37℃45min，再用冰PBS洗2次，做FCM

分析。

3.2.2O2-的测定：培养4h的粒细胞(1.25×106／m1)悬浮于HBSS中，加入细胞

色素C(10mg/ml)和20μl的SOD(1mg/mI)，37℃5min后加入100mmol/LfMIP，并

调节总体积至1ml，37℃15min后迅速冷却，550nm分光光度计测还原型细胞色

素C的吸光度，间接代表的O2-释放量。

3.2.3Annexin-V检测粒细胞凋亡(R＆D公司试剂盒)。

4单核细胞的

将照或未照的PBMC放60mm细胞培养皿中贴壁2h，吸弃悬浮细胞，剩下的

为单核细胞。

5细胞因子的测定

取PHA和LPS混合诱导后的两组上清，用ELISA方法(R＆D公司试剂盒)检

测两组淋巴细胞IL-2和单核细胞TNF-α、IFN-γ的分泌情况。