分子克隆常用的工具酶.ppt

核酸酶BAL31從線形DNA分子兩端（粘端/平端）以漸進方式切去單核苷酸，以形成寡聚核苷酸或製造末端缺失。此外也有類似於SI酶單鏈特異降解活性，可除去粘性末端或單鏈髮夾結構。外切核酸酶Ⅲ能從線性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去單核苷酸，製造3′端缺失，製備DNA範本或特異DNA探針。T4多聚核苷酸激酶能將ATP上的γ位磷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA或RNA的5′-OH上，可將γ-32P-ATP中的32P連接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素標記。????分子克隆常用的工具酶

第一節???????限制性核酸內切酶與DNA分子的體外切割第二節???????DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節???????其他工具酶第一節???????限制性核酸內切酶與DNA分子的體切割限制性核酸內切酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，並由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。一、寄主控制的限制與修飾作用如圖2-1，圖2-2二、限制性核酸內切酶的製備方法三、限制性核酸內切酶分類和命名四、Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特性五、影響限制性內切酶活性的因素分類：ⅠⅡⅢⅠ：識別和切割位點不固定，隨機性。Ⅲ：核酸內切酶活性和甲基化活性是不分開的。Ⅱ：能在識別位點處切割DNA，切割位點固定。核酸內切酶活性和甲基化活性是分開的。常用。四、Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特性識別序列：1.4~7個核苷酸組成的特定核苷酸序列2.回文結構：兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’經限制酶切割後的位點,DNA斷裂類型1.粘性末端(1)3’-OH單鏈延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P單鏈延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’2.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’兩種特殊的限制酶(1)同尾酶識別位點不同，酶切後產生同樣的粘性末段的兩種酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶識別序列相同，對甲基化切點敏感性不同的兩種酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同識別序列GATC，但對GmeATC切點,前者不能切，後者能切。五、影響限制性內切酶活性的因素1.DNA的純度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大腸桿菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改變限制酶的識別特性3.溫度4.分子結構5.限制酶的緩衝液星號活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT第二節???????DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、DNA連接酶DNA連接酶（Ligase）是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復，不能連接單鏈DNA或裂口.溫度二、DNA分子的體外連接二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點的磷酸化2．平末端DNA片段的連接（1）T4DNA連接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化學合成的銜接物連接DNA分子第三節???????其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆轉錄酶五、末端去氧核苷醯轉移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、鹼性磷酸酶十一、???甲基化酶命名HindⅢH:Haemophilus嗜血桿菌屬in:influenzae流感