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骨髓间充质干细胞来源的外泌体在HBx诱导足细胞铁死亡中的作用

摘要

目的：

乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎（hepatitisBvirus-associatedglomerulonephritis,

HBV-GN）作为我国常见的继发性肾脏疾病，其发病机制至今尚不明确，并且缺乏有

效的治疗手段。乙肝病毒X蛋白（HBx）可能诱导足细胞铁死亡，进而在HBV-GN

疾病进展中起重要作用。骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,

BMSCs）产生的外泌体被发现可用于肾脏疾病的治疗，其中发挥关键作用的是外泌

体中携带的microRNAs。但是，BMSCs来源的外泌体对HBV-GN足细胞损伤的影

响尚不清楚。因此，本研究旨在探讨BMSCs来源的外泌体在HBV-GN足细胞铁死

亡中的作用情况。

方法：

采用人肾足细胞过表达HBx基因模拟HBV-GN的发病过程。将人肾足细胞分

为以下6组：空白对照组（不予特殊处理）、阴性对照组（转染阴性对照慢病毒）、

HBx过表达组（转染HBx过表达慢病毒）、HBx过表达+外泌体组（转染HBx过表

达慢病毒和外泌体处理）、HBx过表达+外泌体+inhibitorNC组（转染HBx过表达慢

病毒后外泌体和miRNA阴性对照抑制剂处理）、HBx过表达+外泌体+miR-223-3p

inhibitor组（转染HBx过表达慢病毒后外泌体和miR-223-3p抑制剂处理）。CCK-8

法检测各组细胞的细胞活力；商品试剂盒检测足细胞内铁和MDA含量；流式细胞

术检测足细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）生成；实时定量PCR和Western

印迹法分别检测铁死亡相关分子如酰基辅酶A合成酶长链成员4（acyl-CoA

synthetaselong-chainfamilymember4,ACSL4）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione

peroxidase4,GPX4）和溶质载体家族7成员11（solutecarrierfamily7member11,

SLC7A11）在mRNA和蛋白质水平的表达情况；从BMSCs分离提取外泌体；透射

电镜观察外泌体形态；散射光分析测量外泌体粒径；Western印迹法检测外泌体标志

物CD9、TSG101和calnexin表达；PKH26荧光染色显示足细胞摄取外泌体情况；

实时定量PCR检测miR-223-3p表达情况。

结果：

（1）转染HBx过表达慢病毒后72h或96h时，相较两对照组而言，人肾足细

胞的细胞活力显著下降（均p0.05）。（2）HBx过表达显著增加足细胞中MDA和铁

离子的含量（均p0.05）。（3）流式细胞术检测结果显示，转染HBx后足细胞内ROS

水平明显升高（p0.001）。（4）在蛋白水平和mRNA水平，HBx都可以降低铁死亡

相关标志物GPX4和SLC7A11的表达（均p0.05），增加ACSL4的表达（均p0.05）。

（5）从BMSCs中分离提取外泌体并进行表征。（6）PKH26荧光染色显示足细胞能

够摄取BMSCs来源的外泌体。（7）BMSCs来源的外泌体显著改善转染HBx后72h

或96h时足细胞的细胞活力（均p0.05）。（8）BMSCs来源的外泌体能够减少HBx

过表达时足细胞内铁离子、MDA和ROS的含量，而且在蛋白水平和mRNA水平均

可逆转HBx过表达对足细胞中铁死亡标志分子GPX4、ACSL4和SLC7A11的影响

（均p0.05）。（9）转染HBx降低足细胞内miR-223-3p的表达（p0.001），BMSCs

产生的外泌体中富集miR-223-3p。（10）miR-223-3p抑制剂显著削弱BMSCs来源的

外泌体对HBx诱导的足细胞铁死亡的保护作用。

结论：

（1）本研究首次证明HBx过表达诱导足细胞发生铁死亡，在HBV-GN发病过

程中发挥关键作用。

（2）BMSCs来源的外泌体通过其携带的miR-