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冷冻组织切片的制备

㈠应用恒冷箱切片机制备切片：是目前最适用方法。恒冷箱切片机种类较多，应严格按有关厂商的说明书操作。用于切片的标本必须未曾固定。

㈡应用开放式冷冻切片机制备切片

1.二氧化碳制冷切片

（1）将组织块放在冷冻台上，滴加OCT或羟甲基纤维素液于组织块周围（将组织块包埋），使固定在切片机上的切片刀接近组织块表面。

（2）间断开放液态二氧化碳桶的开关，喷冻组织块和切片刀，使组织块冻结和切片刀制冷。

（3）迅速移动切片刀进行切片：先将组织块修平，然后调节厚度至8~12μm处进行切片。

（4）用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液中固定1min，随即进行苏木精-伊红染色。也可用毛笔将切片拖入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。

（5）组织块也可先在4%中性甲醛中煮沸固定1min，水洗后再行冷冻切片。

2.半导体制冷切片

（1）切片刀与持刀器之间要间隔一层云母片或硬纸片。将冷刀制冷器粘在刀面上。

（2）将组织冷冻台安装在半导体切片机上。

（3）将冷冻台和切片刀制冷器上的导线连接在控制台直流电源上（注意：正负电极不可接反）。

（4）连接制冷器的冷却水管并开始放水，然后开启电源；冷却水管中的水流量不宜过大，在使用过程不得断水。

（5）调整冷冻温度调节器，至切片刀和冷冻台呈现霜冻。

（6）将新鲜组织块或已固定的组织放在冷冻台中央，滴加水或OCT，或用水调成糊状的甲基纤维素于组织块周围（将组织块包埋）。

（7）待组织块冷冻适当后，进行切片。

（8）对于未经固定的新鲜组织，用毛笔将制作满意的切片展平，立即裱贴于盖玻片或载玻片上，待冷冻的切片刚要融化时，立即将其置于冷冻切片固定液中固定1min。对于已经固定的组织块，可用毛笔将制作满意的切片拖入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。

（9）切片完毕后，先关闭电源，再关闭冷却水，待冰霜融化后擦干机器，加罩。

3.甲醇制冷切片（按有关厂商的仪器说明书操作）。

4.氯乙烷制冷切片

（1）将新鲜的或已经固定的组织块置于支持器中央，加少许水或OCT。

（2）连续喷射氯乙烷于组织块上，待组织块冻结后，改为间歇喷射，使冻结适度，立即切片。使用氯乙烷时应注意防火、防爆。

（3）进行组织切片的裱贴、固定和染色（与上述方法相同）。

㈢注意事项

1.制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。

2.切取的组织块大小适宜（厚度2mm），并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。

3.调节冷冻程度，试切合适时便迅速切片。冷冻不足无法切片，冷冻过度

切片易碎。

4.冷冻切片固定液

（1）乙醚－乙醇液

无水乙醚1份

95%乙醇1份

（2）乙醇-冰醋酸液

95%乙醇100ml

冰醋酸3～5滴

五、脱钙方法

骨和其他钙化组织，通常需要脱去钙盐后进行切片。骨组织脱钙前需先行固定。

㈠常规脱钙法：

1.将骨组织锯成薄片（约1×1×0.3cm）。

2.在AF中或4%中性甲醛中固定6～12h。

3.将骨片置于5%硝酸（急需时可置于37℃温箱）中脱钙，只用针轻刺可

入时为止，约需12～24h（小块骨组织脱钙仅需2～3h），其间可更新脱钙液2～3次。

4.流水冲洗1～2h。

5.移入5%甲明矾液，2～4h。

6.流水冲洗2～3h。

7.按常规脱水。

8.石蜡包埋。

㈡电解脱钙法：

将骨片置于装有8%硝酸和10%甲酸混合液的电泳槽（有盖的方形玻璃标本

缸或烧杯）内的阳极处，6V直流电源下持续电解30min～3h，至用针轻刺可入时为止。

㈢骨髓组织脱钙：可浸泡于苦味酸乙醇饱和液（占85%）、甲醛（占10%）和冰醋酸（占5%）的混合液中（同时进行固定和脱钙）。

㈣注意事项

1.骨片等脱钙组织的厚度适宜。

2.脱钙组织与脱钙液的体积比1:30。

3.脱钙过程中应不时摇动，多次更换脱钙液。

4.脱钙时间不可过长。

5.微波处理可加速脱钙过程。

6.脱钙后的组织必须用流水充分冲洗。

7.用于包埋的石蜡硬度适中（不要过软或过硬）。