蛋白质的离子交换层析技术研究进展.pptVIP

降低初始上样缓冲液离子强度注意计算蛋白质的等电点树脂应充分平衡或用严格的再生方法初始上样缓冲液离子强度过大树脂pH值因解吸作用而发生变化树脂未进行适当平衡或再生的树脂未洗净5.2蛋白质不与树脂结合问题处理现在是28页\一共有34页\编辑于星期五树脂上的蛋白质未洗净pH值不合适或蛋白质发生沉淀水解酶破坏了目的蛋白或树脂中有微生物滋生5.3纯化蛋白质的产率低增强溶液离子强度；更换活性高的反离子或使用去垢剂等方法解决。适当调节PH蛋白提取过程中应加水解酶抑制剂抑制蛋白水解问题处理现在是29页\一共有34页\编辑于星期五5.4蛋白质分辨效果差流速太快或层析柱过短梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快上柱蛋白质过多降低流速可采用连续洗脱等梯度变化较慢的洗脱减少上样量问题处理现在是30页\一共有34页\编辑于星期五6.应用实例混合物的分离6.1蛋白质的柱上复性6.2现在是31页\一共有34页\编辑于星期五6.1混合物的分离Bio-Rex70层析分离眼镜蛇神经毒素的6种单乙酰基衍生物眼镜蛇神经毒素，一种小分子碱性蛋白，分子中6个氨基（5个侧链Lys残基和一个游离的N端氨基）均能被乙酰化生成乙酰基衍生物,形成的6种单乙酰基衍生物中净电荷数相同，但表面的电荷分布不同。据此，可以用Bio-Rex70将它们分开。现在是32页\一共有34页\编辑于星期五6.1混合物的分离两步连续离子交换制备色谱分离纯化PEG-rhG-SCF蛋白质聚乙二醇化的反应，生成非PEG化蛋白和不同程度的PEG化蛋白的混合物。因蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低，根据电荷量的差异，通过SP-SepharoseFF和SOURSEQ30作为阳、阴离子色谱连续两步将之分离开来。现在是33页\一共有34页\编辑于星期五6.1混合物的分离蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低。在阳离子交换色谱，PEG化蛋白与介质结合较弱，主要出现在流穿峰中，通过洗脱液将非PEG化蛋白洗脱下来。而在阴离子交换色谱中，由于PEG的“屏蔽效应”阻碍了蛋白与交换剂间的作用，PEG化程度高的蛋白反而易被洗脱。SP-SepharoseFF分离聚乙二醇化的rhG-CSF和未反应的rhG-CSFSOURSEQ30阴离子交换色谱分离不同的修饰组分峰3，2，1分别代表单、双、三聚乙二醇化蛋白现在是34页\一共有34页\编辑于星期五蛋白质离子交换层析技术离子交换层析原理离子交换剂实验条件的确定具体操作方法常见问题及处理12345应用实例6现在是1页\一共有34页\编辑于星期五1.离子交换层析的原理以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。蛋白质（以静电引力为主）的离子交换层析两性分子，不同pH，所带电荷种类和数目不同高级结构，大分子，多位点吸附除静电力还有氢键、疏水作用、范德华力等现在是2页\一共有34页\编辑于星期五待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和杂质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加盐离子浓度，将目标分子和杂质分别洗脱下来，从而实现目标分子和杂质的分离。现在是3页\一共有34页\编辑于星期五2.离子交换剂基本结构2.1指标2.2分类2.3现在是4页\一共有34页\编辑于星期五2.1离子交换剂的基本结构基质应具备的特点：机械稳定性强，适合高流速化学稳定性好，在很宽的pH范围内保持稳定，能耐去污剂、有机溶剂。球形，颗粒均匀。亲水性。高交换容量，要有较大的孔径。水不溶性基质活性基团平衡离子++平衡离子现在是5页\一共有34页\编辑于星期五2.2离子交换剂的指标交换容量：离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。膨胀度：干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。粒径：一般都在3-300μm交联度及网孔结构：交联度越高，机械强度越好，耐压性能越好。电荷密度：基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白质，介质的电荷密度往往较低。以免结合过牢，难以洗脱且易变性。粒径↓→分辨率↑，分离效果↑，但流速↓实际交换容量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某物质的实际容量现在是6页\一共有34页\编辑于星期五2.3离子交换剂的分类根据活性基团的酸碱性质和解离性质：酸碱性质：解离性质：阳离子