2025年RNASeq测序数据分析服务流程试运行.doc

北京大學生科院/CLS生物信息平台

RNA-Seq测序数据分析服务流程

(试运行

.3

平台联络人:李程(

文档撰写:张超

TableofContents

1.测序质量评估(3

1.1测序数据過滤(3

1.2质量值分布(3

1.3GC含量分布(4

2.参照序列比對(4

3.基因体現水平(6

3.1基因体現水平定量(6

3.2基因体現水平分步(6

3.3生物學反复有关性分析(6

3.4样本间层次聚类及PCA分析(7

4.差异基因分析(7

4.1基因体現原则化(7

4.2差异基因列表(8

4.3差异基因可视化(8

4.4差异基因聚类(9

5.差异体現基因功能分析(10

5.1GO富集分析(10

5.2信号通路富集分析(10

5.3癌基因功能注释(11

6.基因构造差异分析(11

6.1可变剪切分析(11

7.SNP分析(12

7.1SNP检测(12

7.2SNP筛选(12

7.3GO/KEGG富集(12

1.测序质量评估

通過测序的数据進行進行质控,保证数据质量适合下游分析。這裏我們使用fastqc和RNA-SeQC来對数据進行质量评估。

1.1测序数据過滤

测序得到的原始下机数据往往有許多問題,不能直接使用,一般會通過如下過滤,尽量保证测序数据的质量。

a.清除带测序接頭的测序序列(reads;

b.清除低质量的reads

1.2质量值分布

按照既有的测序技术(illumina平台單碱基的錯误率应控制在1%如下,即质量值在20以上。

横坐標為reads的碱基位置,纵坐標為單碱基质量值

质量值与錯误率的关系:Q

=-10log10(e;其中Qphred為测序碱基质量值,e為测

phred

序錯误率。

1.3GC含量分布

對于RNA测序,鉴于序列通過超声随机打断,因此理论上每個测序循环上的C、G及A、T含量应分布相等,并且CG-content對于每個物种应大体相似。

横坐標為reads的碱基位置,纵坐標為多种碱基的不一样比例

2.参照序列比對

對于通過质量控制的数据,可以進行後续分析。首先需要将cleanreads比對到参照基因组上。由于测序時reads是随机的,只有這些reads的碱基信息和质量信息,没有其在基因组上的位置信息,比對這一步就是給所有reads一种在基因组上位置的信息。

在RNA测序中,其实测的是cDNA的序列,由于内含子的存在,因此會较常出現一条read跨内含子的状况,tophat2可以很好的处理這种状况,因此我們选用tophat2来做比對。

比對率间接反应了测序的质量和建库的质量,若比對率低,很也許建库時混入了其他物种的序列,导致無法比對到研究的物种参照基因组上。

reads比對到基因上的位置记录:

SampleIntragenic

Rate

Exonic

Rate

Intronic

Rate

Intergenic

Rate

Split

Reads

Expression

Profiling

Efficiency

Transcripts

Detected

Genes

Detected

1BJ0.8850.7380.1470.1149,910,0100.73832,79615,434

(1Sample:样本名

(2IntragenicRate:比對到基因内的reads比例

(3ExonicRate:比對到外显子的reads比例

(4IntronicRate:比對到内含子的reads比例

(5IntergenicRate:比對到基因间区的reads比例

(6SplitReads:比對到两外显子交接处的reads数

(7ExpressionProfilingEfficiency:比對到外显子上的reads占总体的比例

(8TranscriptsDetected:比對上reads数不小于5的转录本数

(9GenesDetected:比對上reads数不小于5的基因数

3.基因体現水平

3.1基因体現水平定量

在RNA-seq分析中,我們可以通過定位到基因组区域或基因外显子区的reads的计数来估计基因的体現水平。Reads计数除了与基因的真实体現水平成正比外,還与基因的長度和测序深度成正有关。為了使不一样基因、不一样试验间估计的基因体現水平具有可比性,人們引入了RPKM的概念,RPKM(ReadsPerKilobasesperMillionreads是每百萬reads中来自某一基因每仟碱基長度的reads数目。RPKM同步考虑了测序深度和基因長度對reads计数的影响,是目前最為常用的基因体現水平估算措施(Mortazavietal.,。

Gene_